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May 16, 2023

ホスホリルコリン

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 5613 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

センチネルリンパ節画像化および生検はがん転移の臨床評価に重要であり、新規の非放射性リンパ造影トレーサーが長年にわたり積極的に研究されてきました。 今回我々は、4T1 マウス乳がんモデルおよび CT26 結腸がん腫瘍マウスモデルにおける流入領域リンパ節の NIR-II (1000 ～ 3000 nm) 蛍光イメージング用に、ホスホリルコリン (PC) リガンドによって官能化された金分子クラスター (Au25) を開発しました。 Au-ホスホリルコリン (Au-PC) プローブは、インドシアニン グリーン (ICG) 色素とは異なり、in vivo で血清タンパク質、細胞、組織との相互作用がほとんどない「スーパー ステルス」動作を示します。 Au-PC の皮下注射により、注射後約 0.5 ～ 1 時間の最適な時間で NIR-II 蛍光イメージングによるリンパ節マッピングが可能になり、その後急速な腎クリアランスが可能になります。 Au-PC を使用した前臨床 NIR-II 蛍光 LN イメージングは​​、高いシグナル対バックグラウンド比、高い安全性、生体適合性を実現し、将来の臨床応用が期待できます。

センチネルリンパ節 (SLN) は、がん転移が最初に発生する原発腫瘍排出節です。 腫瘍細胞は腫瘍周囲のリンパ管から SLN に播種し、その後遠隔リンパ節に播種して、悪性腫瘍細胞のリンパ管拡散を開始します 1。 SLN 生検 (SLNB) は標準的ながんの病期分類法であり、SLN を同定するための放射性同位元素、色素トレーサー、またはその 2 つの組み合わせの腫瘍周囲投与で構成されます 2。 これは、テクネチウム 99m 同位体の一般的なトレーサー (リンパシンチグラフィー用)、蛍光 NIR-I (700 ～ 900 nm) 色素インドシアニン グリーン (ICG)3、4、5、6、7、メチレン ブルー (MB) を術前に投与することによって行われます。 8、9、またはそれらの組み合わせを使用して、SLN に供給されるトレーサーの信号を検出します。 SLNB におけるリンパシンチグラフィーの導入は、これまでのところ、乳がん、黒色腫、頭頸部がんの転移を評価し、病期分類するための臨床腫瘍学における「ゴールドスタンダード」と考えられています 10、11、12。 シンチグラフィーと SPECT/CT および二次可視青色色素の術中投与を組み合わせた臨床試験で、高い SLN 検出率が達成されました。 SLN は通常 10 ～ 60 分 (場合によっては数時間) 以内に視覚化されますが、いくつかの危険因子が 2 ～ 28% の誤検出率に寄与しています 13。 リンパシンチグラフィーの欠点には、核医学施設が不足していること、または放射性医薬品が入手できないことが挙げられます。 放射能を伴う作業は、医療従事者に一定のリスクをもたらします。 また、放射線医学的処置は、一部の患者グループ（妊婦など）では一般的に除外されています14。 その代わりに、ICG は、リンパシンチグラフィーに代わる、より安価で劣らないトレーサーとして、乳がん、皮膚がん、腫瘍がんの LN イメージングに広く使用されてきました 15。 その後の外科的切除と標識リンパ節の病理学的検査により、がんの存在と転移の可能性が評価され、適切かつ効率的な治療への指針が得られます16。

2009 年以来 17、NIR-II ウィンドウ (1000 ～ 3000 nm) での生体システムの生体内一光子蛍光イメージングにより、生物学的構造 (リンパ節を含む) およびプロセスの非侵襲的でリアルタイムの高解像度イメージングが可能になりました。単一細胞および単一血管レベルで 18、19、20、21、22、コンピュータ X 線断層撮影 (CT)23、ラジオイメージング 24、光音響イメージング 25、磁気共鳴画像法 (MRI)26 などの他のイメージングモダリティを補完します。 NIR-II 画像誘導による外科的介入/切除も積極的に推進されています 27,28,29。 NIR-II ウィンドウでの蛍光イメージングは​​、組織による光散乱の減少 30 と抑制された組織の自家蛍光バックグラウンド信号 31 の恩恵を受け、より深い浸透深さ (サブ cm) でのより高い感度、より高い時間的および空間的分解能を実現します 18,19,20,21,22。 800 ～ 900 nm の波長範囲での以前の NIR-I イメージング。 ドナーアクセプター色素32、33、カーボンナノチューブ（CNT）18、34、量子ドット（QD）20、35、希土類ダウンコンバージョンナノ粒子36、37など、一連の有機および無機NIR-IIプローブが使用されています。心血管疾患および外傷性脳損傷 (TBI) の研究における NIR-II による血管構造の皮膚/組織イメージング 18,21,22,38 19,39、がんの分子イメージング 36,40、および免疫療法に対する反応の評価に使用されます。 -生体内での細胞レベル19,22。 NIR-II ウィンドウでのリンパ節イメージングも追求されています 33,35,41 が、NIR-II プローブをさらに進歩させ、高い LN/バックグラウンド比、プローブ投与/イメージングの明確に定義されたタイミング、および高い安全性と迅速なクリアランス。

金分子クラスター 42、43、44、45 は、その分子様構造 46 とその結果得られる特性 47、高い安定性 48、そして重要な安全性と生体適合性 49、50、51 により、多大な関心を集めています。 いくつかの金クラスターは、スペクトルの UV-vis 領域を超えて NIR52、53、54、55、56 に及ぶフォトルミネッセンスを示しています。 > 1000 nm の範囲で発光する水溶性 Au25(GSH)18 (GSH: グルタチオン) クラスターは、頭蓋骨経由の脳イメージングと、in vivo での脳損傷および脳卒中を誘発するリポ多糖類 (LPS) 内の脳血管の検出に使用されました 52。 グルタチオンリガンドでコーティングされた金分子クラスターは、骨基質への効率的な Au-GSH 結合を利用した骨の NIR-II 蛍光イメージングにも使用されました 55。 抗 CD326 標識 56 およびクロリン e6 (Ce6) 光増感剤 54 を負荷した葉酸でキャップされた PEG 化 Au クラスターは、異種移植 MCF-7 および MGC-803 腫瘍マウス モデルにおいて優れた腫瘍浸透性と滞留性を示し、また Ce6 負荷クラスターによる光線力学療法 (PDT) 効果も示しました 54。 これらの進歩にもかかわらず、これまでのところ、NIR-II放出Au分子クラスターを使用したリンパ節イメージングについてはほとんど行われていません。

今回我々は、リンパ節イメージング用の「ステルス」コーティングを施したNIR-II蛍光金分子クラスターを研究する。 私たちは、水溶液中で Au-GSH 分子クラスターを合成し、GSH を 4-アミノフェニルホスホリルコリン (略して p-APPC または PC) リガンドに共有結合させることによって Au-GSH を修飾します。 ホスホリルコリンおよび誘導体は、in vitro および in vivo で生体適合性が高く 57,58,59、酸化グラフェン薄膜 60 や平面金表面 61 などの固体表面上の非特異的タンパク質相互作用に対して高い耐性を与えることがよく知られています。 得られた Au-PC クラスターは、ICG のような血清タンパク質に結合したり、親 Au-GSH クラスターのように非特異的な骨蓄積を持たずに、生体内で「スーパーステルス」プローブとして動作することが判明し、マウスのリンパ節を数分以内にイメージングすることができます。腫瘍内または皮下注射。 Au-PC クラスターは、多くのナノマテリアルとは異なり、注射部位での滞留がほとんどなく、24 時間以内に体からの腎臓排泄率がほぼ 100% に達します。 私たちは、Au-PC 分子クラスターが臨床で人間に使用される NIR-II 蛍光リンパ節イメージング用の有望なプローブになる可能性があると考えています。

我々は、以前に報告された方法62に従って水相でAu-GSHクラスター（図1a）を合成し、次にMES pH 7.0緩衝液中でEDC/NHS化学によってクラスターを4-アミノフェニルホスホリルコリン（PC）リガンドに共有結合させた後、精製しました。 Au-GSH-PC複合体（以下、Au-PCと呼ぶ、図1b）を得る（方法を参照）。 サンプルの紫外可視吸収は、Au-SR クラスター 62 (SR: チオール配位子) に典型的な長波長での減少傾向を示しました (図 1c)。 PCリガンドとAu-GSHの結合により、250 nmでバンプが出現し（PCリガンドに関連、補足図1a）、吸光度が約1.5±0.1倍（または50％）増加し、推定約50 %共役収率（クラスターあたり約18 PCリガンド）、補足図1b。 クラスター表面への PC リガンドの結合は、ATR-FTIR 分光法によってさらに検証されました (補足図 2)。 970 ～ 895 cm-1 における PO2- 基とコリン頭部基の特徴的な非対称 (1240 cm-1) および対称 (1090 cm-1) 伸縮振動モードは、Au-PC 複合体で明確に観察できます。 カルボン酸ナトリウムの存在に起因する1600cm-1での伸縮モードの消失は、Au-PCでは完全に消失した。 各振動モードの詳細な割り当てを補足表1に示します。クライオ電子顕微鏡（補足表2）から得られたAu-GSHクラスター（図1d）およびAu-PC共役体（補足図3）のTEM画像は、次のことを示しています。平均サイズがそれぞれ1.64 ± 0.24 nm（図1e）および1.65 ± 0.22 nm（補足図3b）の狭いサイズ分布を持つ球形粒子。 808 nmのレーザー励起下では、以前の報告と同様に、Au分子クラスターはNIR-II窓でフォトルミネッセンス（PL）を示し、最大ピークは約1090 nmに位置しました（図1c）。 35 mW/cm2の出力密度で2時間連続808 nmレーザー照射を行うと、最初の〜8％減衰の後、時間の経過とともに安定した発光が観察されました（補足図4a）。 2週間の前後における、水、PBS、およびFBS中のAu-GSHクラスターとAu-PCのフォトルミネッセンス（PL）安定性を研究しました（補足図4b、c）。 Au-GSH および Au-PC の PL 強度は、0 日目の水と比較して PBS および FBS 中でわずかに増加しましたが、対応する強度は Au-GSH については約 10 ～ 21%、Au-PC については約 17 ～ 19% 減少しました。 1週間のインキュベーション後。 2週間のインキュベーション後も強度のさらなる低下は観察されませんでした。 808 nmで励起されたAu-GSHおよびAu-PCクラスターの絶対NIR-II発光量子収率は、積分球法を使用して900〜1500 nmの発光範囲でそれぞれ〜0.27および0.38％と測定されました（「方法」を参照）。

Au25 クラスター構造の結晶学的表現。 要素のカラーコード: コアの Au (0): 黄色、ステープル モチーフの Au (I): オレンジ、ステープル モチーフの S: 緑色。 この構造は、参考文献 46 で公開されている結晶構造データに基づいて、UCSF キメラ プログラム (バージョン 1.12) を使用して調製されました。 b Au-GSH クラスターの後官能化および Au-PC 共役構造の概略図。 明確にするために、1 つのステープル モチーフと隣接する金コア原子のみを示しています。 簡単にするために、PCリガンドのグリシンカルボン酸基への結合は省略され、GSHのγ-グルタミン酸カルボン酸官能基のみを示しています。 c 水相中のAu-GSHクラスターのUV-vis吸収および蛍光スペクトル。 d 平均サイズ 1.64 nm ± 0.24 nm の Au-GSH クラスターの CryoEM 顕微鏡写真 (n = 3)。 e クライオEM顕微鏡写真から得られたAu-GSHクラスターの粒径分布の記述統計分析。 m / z 1000から3000の負イオンモードでのAu-GSHクラスターのESI-MSスペクトル：5〜8のいくつかの負に帯電した種が特定され、残りのピークは小さく、不純物クラスター/種に起因すると考えられます。 g 推定ナトリウム付加物を含む主要ピーク 5 ～ 8 の ESI-MS スペクトルは、一般的な [Au25(GS)18 + xNa-xH-zH]z 式に割り当てられました。 au：任意の単位。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

合成された金クラスターは、プラズモニック特徴を持たない本質的に分子状（超小型サイズ < 3 nm）であり、平均して Au25-GSH であることが特徴付けられました（図 1f、g）が、ある程度の不均一性がありました 62。 エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量分析測定により、ナトリウム付加物を持ついくつかの負に帯電した種（図1f）が特定され、[Au25(GS)18 + xNa-(xz)H]z-に割り当てられました。ここで、xはナトリウム付加物の数、z は電荷です (図 1g)。

インビトロでは、4T1 マウス乳がん細胞と CT26 結腸がん細胞を異なる質量濃度のクラスター (1 mg/mL、5 mg/mL、および10 mg/mL 濃度、37 °C で 12 時間 (補足図 5)。 GSH および PC リガンドは両方とも天然に豊富に存在する生体分子であり、金は安全な元素であるため、これは驚くべきことではありません。 GSH は、活性酸素種 (ROS) 活性に対する抗酸化防御、栄養素代謝、および細胞事象に関与しています 63。一方、PC リガンドは細胞膜の構成要素です。

Au-GSHクラスターおよびFBSとのAu-PCコンジュゲートの血清タンパク質結合能力を評価し、ICGのそれと比較しました。 簡単に言うと、クラスターとICGをFBSとともに37℃で1時間インキュベートしました（補足図6）。 その後、Amicon 50 kDa 遠心分離フィルターを使用して溶液を濾過しました（補足図6a、b）。 血清タンパク質に結合した金クラスターはフィルターを通過しませんが、結合していない遊離クラスターは濾液に失われます。 808 nmでの濾液（Au-GSHおよびAu-PCの場合）および保持液（ICGの場合）の光学密度（OD）を測定し、対応する血清タンパク質結合効率を計算しました（補足図6c）。 Au-GSH + FBS および Au-PC + FBS 濾液、ICG + FBS 保持液の実験の概略図、数値、吸光度値は、補足図 6 にあります。 Au-GSH クラスターの血清タンパク質結合効率、Au-PC 複合体および ICG は、それぞれ 2.7%、1.74%、および 94.5% と計算されました。 つまり、94.5% の ICG のほとんどが血清タンパク質に結合し、フィルターを通過できないことが判明しました。 Au-GSH と Au-PC は両方とも、血清タンパク質、特に Au-PC との相互作用がはるかに低かったのに対し。

In vivo では、PBS に溶解した Au-GSH および Au-PC クラスターを最初にマウス (5 ～ 7 週齢の雌 Balb/c、各グループ n = 3) に尾静脈注射によって静脈内 (iv) 投与しました。 >1100 nm NIR-II ウィンドウで臨床的に承認された ICG 色素と並べて比較しました。 マウスの膀胱NIR-IIシグナルは、急速な腎クリアランスのための腎臓ドレナージの結果として、注射後（pi）〜3分で急速に点灯しました（図2a、b腹側図）（補足図2の背側/側面図）。それぞれ7aおよび8a）。 ICG は、>1000 nm の NIR-II ウィンドウに及ぶ蛍光テールを示すことが示されました 64。 静脈内注射された ICG では、ICG と血清タンパク質結合複合体の形での胆汁排泄経路と一致して、肝臓と腸で強い NIR-II シグナルが観察されました 65 (図 2c)。 身体信号は注射後 24 時間後に消去され、主要臓器に顕著な ICG の滞留はありませんでした (補足図 9)。

静脈内 (iv) の広視野 NIR-II 蛍光画像 (出力密度 70 mW/cm2 の 808 nm レーザー、Au と ICG の露光時間 40 ms と 4 ms、1100 nm ロングパス フィルターで励起)異なる時点で、Au-PC コンジュゲート (4x、約 1.2 mg)、b Au-GSH クラスター (4x、約 1.2 mg)、および (c) ICG (50 μL、50 mM) プローブを注射しました (6 ～ 7 週齢の雌) Balb/c、n = 3)。 d Au-PC および e Au-GSH 蛍光プローブの注射後 24 時間の主要臓器における生体内分布。 エラーバーは、3 回繰り返された実験の標準偏差 (SD) を表します。 棒グラフのデータは平均値 ± SD として表示されます。 f 健康なマウスおよび注射後 24 時間の Au-PC コンジュゲートを注射されたマウスのヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色された主要臓器の組織切片の微細解剖学 (対物レンズ 20 倍、スケール バーは 100 μm)。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

静脈内投与された Au-GSH クラスターは、中心骨格系 (特に脊髄と関節、補足図 8c) にある程度の非特異的蓄積/保持を示しました。 ICP-MS分析により、静脈注射されたAu-GSHの約64％が投与後1時間以内に尿とともに排泄され、1日で合計約73％の排泄に達し、約1％の金が肝臓に、0.35％が腎臓に残ったことが示されました。 (図2eおよび補足図8b)。 Au-PCの場合、そのような骨シグナルは観察されなくなり、Au-PCは主要臓器に滞留することなく尿とともに自由に排泄され、血清タンパク質に結合しないAu-PCクラスターの高度なステルス性を示唆しています（補足図7c）。 Au-PCの〜81％が感染後1時間以内に尿中に排泄され、感染後24時間後には〜93％までさらに増加し​​たことが観察されました（図2dおよび補足図7b）。 Au-PC クラスターは高度にステルス性があり、タンパク質や他の生物種との非特異的相互作用はほとんどありません。これは、実験とシミュレーションによって金上のアルキルチオール PC 単層について以前に解明された 2 つの要因が寄与している可能性があります 66。 1 つ目は、静電気力を介した水分子による両性イオン PC 基の強力な水和であり、2 つ目は、Au 表面に対してほぼ垂直に逆平行に配向した PC ヘッド基の最小の正味双極子モーメントです 66。 どちらの要因も、Au-PC とタンパク質間の非特異的相互作用を最小限に抑えることに寄与したと考えられます。

未処理のマウスとAu-PCコンジュゲートを注射したマウスのヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色した主要臓器の組織切片には差異が見られず（図2f）、in vivoで静脈内注射されたAu-PCプローブの高い安全性が示唆されています。

リンパ節イメージングのために、同系 4T1 マウス乳房腫瘍を有するマウス (5 ～ 7 週齢の雌 Balb/c、各グループ n = 3) に Au-PC クラスターの腫瘍内/腫瘍周囲投与 (it) を実行しました。補足ビデオ 1 ～ 3、in situ プローブ投与および流入リンパ節のリアルタイム NIR-II in vivo イメージング）および後肢に接種された CT26 結腸腫瘍（補足ビデオ 4、5、in situ プローブ投与およびリアルタイム NIR-II流入リンパ節の生体内イメージング）。 4x (~1.2 mg、両後肢の腫瘍、補足ビデオ 1)、1x (~300 μg、右後肢の腫瘍、補足ビデオ 2) および 1/3x (~100 μg、右後肢の腫瘍、補足ビデオ 3) が投与されました (図 3a、補足図 10、11)。 流入鼠径リンパ節（iLN）は、感染後〜1分以内にAu-PCのNIR-II発光を示し始め、感染後〜3分以内に高輝度に達しました（図3a、4T1の補足図11、4T1の補足図12a） CT26腫瘍）。 LNシグナルは、感染後約30分でピーク強度に達した後、排出iLNで1時間以上持続し（図3a）、LN /バックグラウンドシグナル比は約5〜10でした（図3d、補足図12d）。 感染後10分で、腋窩領域に達するiLNからのリンパ管内のAu-PC NIR-II発光を観察し、4T1マウスモデルとCT26マウスモデルの両方で腋窩LN（aLN）を弱く標識しました（補足図13a、b）。 。 シグナルは、Au-PCプローブの投与後30分後に完全に消失した。 Au-PC クラスターは、上位層のノードではるかに弱い信号を持つ一次層ドレイン LN の迅速かつ効果的なイメージング/検出を可能にしました。

広視野NIR-II蛍光画像（出力密度70 mW/cm2の808 nmレーザーで励起、Au-PC、Au-GSH、ICGの露光時間はそれぞれ20、40 ms、4 ms、長さ1100 nm） (パスフィルター) の (周囲) 腫瘍内 (it) に Au-PC コンジュゲート (1x、約 300 μg)、b Au-GSH クラスター (1x、約 300 μg)、および c ICG (50 μL、50 mM) プローブを注入しました。後肢に 4T1 腫瘍を有するマウス (生後 6 ～ 7 週齢の雌 Balb/c、n=3) に、さまざまな時点で実験を行いました。 d Au-PC 複合体、e Au-GSH の注射後最大 6 時間までの鼠径リンパ節 (iLN) の正規化された蛍光強度 (左 Y 軸) およびリンパ節シグナル対バックグラウンド (LN/B) 比 (右 Y 軸)クラスターおよび f ICG 蛍光プローブ。 エラーバーは、3 回繰り返された実験の標準偏差 (SD) を表します。 データは平均値±SDとして表示されます。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

Au-PCと比較するために、4T1腫瘍（5〜7週齢の雌Balb/c、各グループn = 3）へのAu-GSHプローブの投与を実行しました（図3bおよび補足図12cの右側面図、補足ビデオ 6、7、in situ プローブ投与および流入領域リンパ節のリアルタイム NIR-II in vivo イメージング）および CT26 腫瘍（補足図 12b、補足ビデオ 8、9、in situ プローブ投与およびリアルタイム NIR-II） II 排出リンパ節の in vivo イメージング）、LN 排出プロセスのはるかに短い期間が観察されました。 Au-GSHの1x（図3b、e）および4x（補足図12b、c）用量投与時にLNで検出されたNIR-IIシグナルは比較的低く、強度に大きな違いはありませんでした。 iLN のシグナルは、感染後約 10 分後に急速に最大強度に達し、LN/バックグラウンド (LN/B) シグナル比は、4T1 腫瘍の場合約 2 ～ 4 (図 3e および補足図 12f)、および約 6 ​​～ 7(補足図 12e) はそれぞれ CT26 腫瘍であり、リンパ系からすぐに除去されました。 同様に、非常に弱い aLN が検出されました (補足図 13c)。 これらの結果は、Au-GSH が Au-PC よりも理想的ではない LN イメージング剤であることを示唆しました。後者は、注射後約 1 時間の長い時間スケールにわたって LN をより明るく照らすからです。

補足図。 図１４、１５は、１×Ａｕ−ＧＳＨおよびＡｕ−ＧＳＨの腫瘍内投与後の、最も高いリンパ節排出時点、すなわち、Ａｕ−ＧＳＨについては感染後１０分、Ａｕ−ＰＣについては感染後３０分における主要臓器におけるＮＩＲ−ＩＩ蛍光シグナルを示す。 PCプローブ。 Au-GSHプローブの投与10分後のiLNのNIR-IIシグナルと比較して、Au-PCコンジュゲートの投与後30分後には約3〜5倍高いLNシグナルが観察されました（補足図16）。

Au-PCおよびAu-GSHプローブと比較すると、ICGが劇的に異なるSLN排出動態を示すことが観察されました（図3c、補足ビデオ10、11、in situプローブ投与および流入リンパのリアルタイムNIR-II in vivoイメージング）ノード、5 ～ 7 週齢の雌 Balb/c、n = 3)。 ICGシグナルがSLNに最初に現れる時間は、Au-PCおよびAu-GSHのものより長く、4T1腫瘍への注射後10分〜30分の範囲でマウスごとに異なりました。 ICG6,7 は血清タンパク質に結合し、SLN 排出の速度を遅くすることが知られています。 リンパ節内のシグナルは徐々に増加し、注射後2〜3時間でピーク強度に達し、LN/B比は〜4でした（図3f）。 これは、特定のがん（口腔がんなど）のセンチネルリンパ節で示されるICG蛍光シグナルのタイミングが変動し、注射と画像化/手術の間のタイミングに不確実性が生じることを発見した臨床研究と一致したもので、15分から15分までの範囲であった。 6月16日24時まで。 経時的な画像化では、場合によっては、第 1 層の dLN に加えて高次層のリンパ節が観察されました。 この点において、Au-PC クラスターは、タンパク質や細胞との相互作用がほとんどなく、リンパ管を妨げられることなく輸送され、タイミングの不確実性がほとんどなく、注射後数分から約 1 時間の快適な広い時間枠で dLN イメージングを可能にするという点で大きく異なりました。

静脈内注射の場合と同様に、腫瘍内に注射された Au-PC および Au-GSH プローブは腎臓経路を介して体外に排泄されました (図 4)。一方、ICG は肝臓排泄系を介して除去されました。 24時間以内に、排泄物のICP-MS分析により、注射されたAu-PCサンプルの約92％が尿を介して排泄されたことが示されました（図4a、b）が、Au-GSHではわずか38％の尿排泄が観察されました（図4c、図4c、図4b）。 d)。 腫瘍注射部位およびマウスの体からのほぼ完全なシグナルの消失が、Au-PC プローブの場合は感染後 24 時間で観察され（図 3a）、同時に、Au-GSH の腫瘍注射部位では有意なシグナルが依然として検出されました。 (図 3b) および ICG プローブ (図 3c)。 Au-PC クラスターは、ICG および Au-GSH と比較して、注射部位および体内での捕捉と保持が最も少なく、最小限の相互作用と非特異的結合を与える表面ホスホコリンリガンドによる Au クラスターの高度なステルス性を示唆しています。体内のタンパク質、細胞、組織/器官との関係。

a、c 4T1 腫瘍を有するマウスに Au-PC および Au-GSH 蛍光プローブを腫瘍内 (it) 48 時間投与した後の急速な腎排泄プロファイル (a 感染後 24 時間まで) および b、d 主要臓器の生体内分布それぞれ後肢 (n = 3)。 a と c の挿入図は、Au の異なる時点で収集された尿サンプルの NIR-II 蛍光画像 (出力密度 70 mW/cm2、露光時間 40 ms、1100 nm ロングパス フィルターで 808 nm レーザーで励起) を表します。それぞれ -PC と Au-GSH。 エラーバーは、3 回繰り返された実験の標準偏差 (SD) を表します。 データは平均値±SDとして表示されます。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

次に、マウス尾基部での 3 つのプローブの皮下 (sc) 注射後の LN 排出を調査しました (図 5) (5 ～ 7 週齢の雌 Balb/c、各グループ n = 3)。 Au-PCクラスターは、注射後3分以内に、注射部位を排出iLNに接続するリンパ管に移動しました（図5aおよび補足図17）。 iLN の強いシグナルは 1 時間まで見られ、感染後 2 時間で約 40% 減少しました (図 5d)。 24 時間以内に、Au-PC シグナルは体内から消失し、注射部位にはほとんど残りませんでした（補足図 17）。 皮下注射された Au-GSH クラスターの場合、iLN 内のシグナルは 30 分でピークに達し、感染後 2 時間で約 50% 減少し、24 時間後には注射部位からほとんど消失しましたが、中心骨格フレームワークで有意なシグナルが観察されました。 (図5b、eおよび補足図18)。 24 時間以内に、ICP-MS 分析により、注入された Au-PC サンプルの約 92% が尿を介して排泄されたことが示されました (補足図 19a、b)。一方、Au-GSH では約 71% の尿排泄が観察されました (補足図 19c、補足図 19c、補足図 19c、 d)。 対照的に、ICG投与時(図5c)、iLNの蛍光シグナルは注射後3分で出現したが、その強度は注射後の同時点のAu-PCプローブの強度と比較してはるかに低かった(図5f)。 感染後 2 ～ 3 時間後 (またはそれ以降)、iLN 内の ICG シグナルはピーク強度に達し、持続しました。 感染後24時間後でも、リンパ節、注射部位および肝臓には有意なシグナルが依然として残存していた(図5fおよび補足図20)。 注射部位におけるＩＣＧの保持は、Ａｕ－ＰＣよりもはるかに長い期間にわたって持続した（図５Ｆ）。 また、Au-PC 分子クラスターは、量子ドット (QD)、カーボン ナノチューブ (CNT)、および有機 NIR II 色素を含むさまざまなナノ材料 (PEG などの十分にコーティングされた親水性層を持つ) の中で、皮下注射部位にほとんど保持されない独特なものでした 67,68。 注射部位でNIR-IIプローブを捕捉し、数週間にわたって染色することは、潜在的な長期副作用のため望ましくない。

両側皮下（sc）の広視野NIR-II蛍光画像（出力密度70 mW/cm2の808 nmレーザー、AuとICGの露光時間それぞれ100 msと4 ms、1100 nmロングパスフィルターで励起） ）異なる時点で、Au-PC コンジュゲート（4x、約 1.2 mg）、b Au-GSH クラスター（4x、約 1.2 mg）、および c ICG（50 μL、50 mM）プローブを注射しました（生後 6 ～ 7 週齢のメスの Balb /c、n=3)。 注射後 6 時間までの右 (R) 鼠径リンパ節 (iLN) の正規化された蛍光強度 (左 Y 軸) と、金注射後 24 時間までの注射部位周囲の関心領域シグナル (ROI、右 Y 軸) PC (d)、Au-GSH (e)、および ICG (f) 蛍光プローブ。 エラーバーは、3 回繰り返された実験の標準偏差 (SD) を表します。 データは平均値±SDとして表示されます。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

また、Au-GSHクラスター（1x、〜300μg、補足図21、23）およびAu-PCコンジュゲート（1x、〜300μg）の系統的な静脈内（iv）および皮下（sc）投与後の長期運命研究も実施しました。 μg、補足図22、24）を毎週マウスに投与した（生後3週目の雌Balb/cから開始、各グループn = 3）。 NIR-II 画像は、プローブの投与による迅速な腎クリアランスと LN 排出を示しています。 体重増加対時間のプロットは、生理食塩水のみで治療した対照グループと同様の傾向に従って着実な増加を示しています（補足図25）。 48日目（iv）および47日目（sc）に採取された血液サンプルの全血球計算（CBC）分析では、明らかな毒性作用は示されていません（補足図26）。 得られた結果は対照グループと同等でしたが、サンプルチューブ内に存在する血餅により若干のばらつきがありました。 赤血球の形態は正常のままでした。 ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色臓器の組織切片の病理学的検査では、組織レベルでの損傷は示されていません（補足図27）。

最後に、1x用量のAu-PC（図6a）およびICG（図6b）（5〜7週齢の雌Balb/c、各グループn = 3）の腫瘍内注射を実行し、NIRを検出することによってLNイメージングを比較しました。 -II それぞれのピーク強度時点でのドレイン iLN 内の増加する波長でのプローブの発光 (同じ 808 nm 励起下)。 Au-PCおよびICGベースのLNイメージングの半値全幅（FWHM）を900 nm以上、1100 nm以上、1200 nm以上、1300 nm以上の発光窓で分析しました（図6C）。 発光波長が増加すると、断面プロファイルの広がりは明らかに減少し、リンパ節の測定された半値全幅（FWHM）は3.8、3.5、3.2から2.8 mmに減少し（図6c）、画像解像度の増加を示唆しています。より長い発光で。 LN/B比も増加し、特に>1300 nmのイメージング範囲でAu-PCのLN/B比が高くなりました（図6d）。 Au-PCの1300 nm以上の発光で測定されたLN / B比は〜22に達し（図6d）、一次層ノードの明確な識別/画像化が可能になりました。

4T1 腫瘍を有するマウス（生後 6 週間）に 1x Au-PC コンジュゲートと b ICG プローブを注入した腫瘍内（it）の広視野蛍光画像（出力密度 70 mW/cm2 の 808 nm レーザーで励起）メスの Balb/c、n=3)。 画像は、異なるNIR-IウィンドウおよびNIR-IIウィンドウで、Au-PCおよびICGについてそれぞれ感染後30分および3時間後に撮影された右側の側面図を示しています。 >900 nm、>1100 nm、> 1200 nm、> 1300 nm の発光を検出するための露光時間は、Au-PC の場合は 25 ms、20 ms、90 ms、400 ms、Au-PC の場合は 0.4 ms、3 ms、15 ms、100 ms でした。それぞれICG。 c Au-PC投与後のiLNの蛍光強度断面プロファイル。 ラインプロファイル上の LN 信号とバックグラウンド (B) の位置は矢印でマークされています。 （ d ）異なるNIR-IおよびNIR-IIサブウィンドウでの右（R）鼠径リンパ節（iLN）のリンパ節シグナル対バックグラウンド（LN / B）比の比較。 エラーバーは、3 回繰り返された実験の標準偏差を表します。 ソース データはソース データ ファイルで提供されます。

センチネルリンパ節 (SLN) の検出と正確な同定、その後のセンチネルリンパ節生検は、臨床現場におけるがんの病期分類、転移評価、およびさらなる治療にとって最も重要です 33,69。 臨床的に承認されている ICG4,16 やメチレンブルー 8,9 を含むいくつかの NIR-I 色素は、さまざまながんの潜在的な蛍光トレーサーとして広く研究されていますが、迅速なクリアランスと少ない副作用で高い LN 標識能力を与える新規蛍光色素の探索が求められています。やはりvivoが望ましいです。 ICG は長年にわたって臨床で SLN イメージングと生検に使用されており、SLN イメージング/同定の有効性、生体適合性、安全性において高い実績があります。 しかし、少数の患者 (<0.34%)70 は副作用を発症しました。これは、ICG と体内の細胞/組織との反応に起因すると思われます。 ICG LN イメージングに関して報告されたもう 1 つの現象は、流入リンパ節でピークに達する ICG 信号のタイミングが変動することであり、これによりイメージングと手術の最適なタイミングが不確実になる6,16。

ここでは、同系の 4T1 マウス乳房および CT26 腫瘍マウスモデルにおける SLN 検出およびマッピングのための、NIR-II 蛍光による分子金ナノクラスターを研究しました。 水溶液でのワンポット合成により、L-グルタチオンでコーティングされたAuクラスターが得られ、ホスホリルコリンリガンド（Au-PC）によるさらなる官能化により、生体適合性の高い「ステルス」NIR-IIプローブが得られました。 Au-PC NIR-II 発光の量子収率 (QY) は約 0.38% で、高くはありませんが、0.3 ～ 1.2 mg (腫瘍あたり平均) の注射量で腫瘍内注射したときに明るい LN シグナルを生成するには十分でした。腫瘍サイズ約 15 cm3）、安全な 70 mW/cm2 808 nm 励起下、20 ～ 40 ms の画像取得時間でのイメージングが可能です。 Au 分子クラスターの NIR フォトルミネッセンス/蛍光のメカニズムは複雑であり、まだ議論中です 71。 Au25 クラスターの場合、NIR 放射は主に Au13 の正二十面体コアから発生することが示されました 72。 固有の構造剛性 73 またはテトラオクチルアンモニウム (TOA) カチオンによる表面硬化 74 と、クラスター内の「ロックリング」および「ロック原子」の存在 75 が、チオール化金クラスターの NIR 発光量子効率に強く影響することが判明しました。 私たちの現在の合成では、主に Au25 が生成されましたが、少量の他のクラスターが含まれていることが知られています 76。 ~100% Au 分子クラスターを生成し、蛍光メカニズムを理解し、より高い量子収率で最適な Au クラスターを設計するために合成を改善する余地はまだあるはずです。

生命システムに固有の安全な生体分子としてのホスホコリンリガンドのおかげで、Au-PC 分子クラスターは、タンパク質、細胞、組織との相互作用/結合が無視できる程度で生体内で「スーパーステルス」挙動を示すという点で独特であり、尿を通じて排泄されます。注射経路（静脈内、腫瘍内、皮下）に関係なく、主要臓器や注射部位にほとんど残留しません。 ｉｔおよびｓｃ注射されたＡｕ－ＰＣは、数分から数時間以内に衰えることなく急速に流入リンパ節に移動した。 これは、注射部位に数日から場合によっては数カ月も留まる傾向があるほとんどのナノ材料（ナノチューブ、QD など、PEG ポリマーなど水性が高く安定したコーティングを有するものであっても）とは大きく異なります 77。 Au-GSH プローブも in vivo でステルス特性を示しましたが、中央骨格フレームワークにある程度の非特異的蓄積が見られ 55、LN 排出時間枠は Au-PC の場合よりも低い LN シグナルではるかに短いようでした。

4T1 腫瘍および CT26 腫瘍を有するマウスに腫瘍内投与した後の Au-PC の LN 流入薬物動態は、~1 分以内に流出鼠径リンパ節に到達し、ピーク強度で 30 分から 1 時間持続し、後の時点で徐々に消失しました。 。 Au-PC プローブを使用すると、注入直後に LN イメージングを排出でき、約 1 ～ 2 時間のイメージング ウィンドウが得られます。 これは、迅速な診断と介入の決定が必要な臨床状況や、ICG16 で報告されているような画像化タイミングのばらつきを回避するために役立つ可能性があります。 手術中に Au-PC を注入した直後にすべての SLN をイメージングすることが可能になり、最適な時点に到達するまでに何時間も待つ必要はありません。 Au-PC と身体および腎臓の排泄物との相互作用/結合が無視できる程度であるため、ICG が示す有害な副作用の残りの可能性も排除できる可能性があります 70。

Au-PC と ICG はどちらも 1000 ～ 1400 の範囲で NIR-II 蛍光を示し、発光テールは 1300 nm を超えます。 >1300 nm 範囲でのイメージングは​​、侵入深さ、信号/バックグラウンド、および画像の鮮明さの点で最適ですが、より長い露光時間 (~400 ms) が必要です。 Au-PC の >1300 nm 発光で測定された LN/バックグラウンド シグナル比は約 22 と高く、排出中の LN を明確に識別できました。 ICGも同様に1300 nmを超える有用な発光を示しましたが、腫瘍注射部位近くの拡散シグナルによって引き起こされるAu-PCほど高いLN /バックグラウンドシグナルが常に観察されるわけではないことがわかりました（図6b）。 画像誘導手術の研究では、ICG のような小さなシアニン色素が拡散して生体分子に非特異的に結合する傾向を示し、全体的なシグナル バックグラウンドを引き起こすことが判明しました 78。 これは、ICG it 注射の場合の高いバックグラウンド信号と裏付けられました (図 3c および 6b)。 Au クラスター (Au-PC と Au-GSH の両方) にはそのような拡散性および非特異的結合挙動がなく、dLN のより鮮明でターゲットを絞ったイメージングが可能になりました。 この重要な特性は、Au 分子クラスターをシアニン色素と区別し、正常な血管からのクラスターの血管外漏出を遅らせ、癌組織へのクラスターの標的化を強化する方法として報告されました 44。

テトラクロロ金酸水素(III)三水和物 (Sigma-Aldrich、≥99.9% 微量金属ベース)、還元型 L-グルタチオン (GSH、Sigma-Aldrich、≥98.0%)、水素化ホウ素ナトリウム (Sigma-Aldrich、≥96%)、1-( 3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC)、N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS、Thermo Scientific) および 2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール (トリス塩基) を受け取ったまま使用しました。 DI 水とインドシアニン グリーン (ICG) は Fisher Scientific から購入しました。 4-アミノフェニルホスホリルコリン (PC) は、Santa Cruz Biotechnology Inc. から購入しました。

典型的な合成62では、5 mgのHAuCl4・3H2O（0.013 mmol、1.3 mM、ガラス製スパチュラを使用して秤量）を丸底ガラスフラスコ内の10 mLの脱イオン水に溶解し、16 mgの還元L-グルタチオン（0.052 mmol）と混合しました。 、５．２ｍＭ、１０ｍＬの脱イオン水中）により、わずかに乳白色の溶液が形成された。 溶液を数分間激しく撹拌し、その後中間体GSH-Au(I)錯体を水10mL中の新たに調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液5mg(0.13mmol、13mM)で還元すると、すぐにわずかに乳白色の溶液が得られた。暗褐色に変わり、一般的な式 Aun(GS)mq を持つさまざまなナノサイズのクラスターが形成されていることを示します。ここで、n はクラスター内の金原子の数、m はグルタチオン リガンドの数、q はグルタチオンの正味電荷です。クラスター。 反応混合物を室温で２４時間連続エッチングすることにより、最終生成物、すなわち、Ａｕ２５（ＧＳ）１８が形成された。 サンプルの精製は、15 mL Amicon 3 K フィルターと水を使用した 5 ～ 6 回の遠心分離 (4400 rpm) によって完了しました。 濃縮した溶液は、さらに使用するために 4℃ で保存しました (Au-GSH と表示)。

PCリガンドによるクラスターの表面修飾は、EDC/NHS化学を使用して実行されました。 簡単に説明すると、約 36 当量（クラスター内の -COOH 基の理論数）の 4-アミノフェニルホスホリルコリン リガンドを MES pH 7.0 緩衝液中の Au-GSH クラスター（1x、300 μg）に添加し、続いて 100 mM EDC とNHS。 結合は、オービタルシェーカー上で室温で３時間実施し、その後、ＧＳＨの残りのカルボキシル基をＴＲＩＳ １００ｍＭの添加によってブロックし、さらに１時間反応させた。 最終的な Au-GSH-PC コンジュゲート (以下、Au-PC) を、Amicon 3KDa 遠心分離フィルターを使用して PBS pH 7.4 緩衝液で数回洗浄し、その後使用するために 4℃ 冷蔵庫に保管しました。

ＵＶ−可視スペクトルは、光路長２ｍｍの石英キュベットを使用して、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ６０００ｉ ＵＶ／Ｖｉｓ／ＮＩＲ分光光度計で記録した。 スペクトルは、水中で200〜1000 nmの範囲で、走査速度200 nm min-1、スペクトル帯域幅2 nmで測定されました。 発光スペクトルは、InGaAs線形アレイ検出器(Princeton OMA-V)を備えたActon SP2300i分光計によって測定した。 量子収率は積分球法を使用して測定されました。 ESI-MS 分析は Bruker MicroTOF-Q II で実行されました。 サンプルはシリンジポンプによって 3 µL/min で導入され、フルスキャン MS スペクトルが負イオンモードで収集されました。 誘導結合プラズマ質量分析 (ICP-MS) は、Thermo Scientific ICAP 6300 Duo View 分光計で実行されました。 赤外スペクトルは、Nicolet iS50 FT/IR 分光計で測定しました。 PC リガンド、Au-GSH クラスター、および Au-PC コンジュゲートをダイヤモンド内部反射素子 (IRE) 上にドロップ キャストし、空気中で乾燥させました。 IRスペクトルはATRモードで測定しました。 スペクトルは、400〜4000 cm-1の範囲で4 cm-1のスペクトル分解能で記録されました。

3 µL の Au-GSH および Au-PC サンプル (濃度: 6.0 µg/µL) をグロー放電 R1.2/1.3 Quantifoil グリッドに適用しました。 グリッドを濾紙で吸い取って余分なサンプルを除去し、Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific、米国) を使用して液体エタンに素早く浸しました。 TEM 画像は、加速電圧 300 kV の K3 直接電子検出器を備えた Titan Krios G3 クライオ電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific、米国) を使用して収集されました。 顕微鏡写真は、ピクセルサイズ1.08Åおよび電子線量30e-/Å2で-1.0μmデフォーカスで収集した。

Au-GSH および Au-PC の絶対量子収率は、積分球 (Thorlabs; IS200) を使用して測定されました。 プローブは 808 nm レーザーで励起され、発光は 900 ～ 1500 nm で収集されました。 入射光を統合球体で拡散した後、液体窒素冷却 InGaAs 線形アレイ検出器 (Princeton OMA-V) を備えた分光計 (Acton SP2300i) を備えた自作の NIR 分光器を使用して、結果の光を収集しました。 絶対量子収率は次の方程式に従って計算されました。

ここで、QY は量子収量、E[sample] は発光強度、L[blank] と L[sample] はそれぞれ水と NIR-II プローブ サンプルの存在下での励起光の強度です。

4T1 マウス乳がん (ATCC CRL-2539) および CT26 結腸がん (ATCC CRL-2638) 細胞株に対する Au-GSH および Au-PC の細胞毒性を、MTS アッセイ (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega) を使用して評価しました。 ）。 この研究で使用された細胞株は、マイコプラズマ感染症については陰性でした。 細胞を、10% FBSおよび1% ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質を補充したRPMI 1640培地に96ウェルプレートのウェルあたり5×103細胞で播種し、付着のために24時間放置した。 5% CO2 の加湿雰囲気中、37 °C で 24 時間インキュベートした後、細胞を 200 μL の基本培地で 2 回洗浄し、その後、さまざまな濃度の Au-GSH および Au-PC を各ウェルに 3 回加えました。 12時間の内部移行後、細胞を培地で3回洗浄し、その後MTSを各ウェルに添加した。 インキュベーションの4時間後に、Multiplate Reader (Tecan)を使用して吸光度を測定した。

すべての動物実験はスタンフォード大学動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。 この手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実行されました。 3 ～ 9 週齢の BALB/c 雌マウス (体重: 15 ～ 20 g) を Charles River から購入しました。 マウスは、スタンフォード大学獣医サービスセンターにおいて、周囲温度 = 20 ～ 25 °C、湿度 = 50 ～ 65% の条件で 12 時間明/12 時間暗所で飼育されました。 寝具、巣材、餌、水はスタンフォード VSC 施設から提供されました。 各実験の前に、マウスの毛を除毛ローション（Nair、Softening Baby Oil）を使用して剃った。 インビボイメージングのために、マウスは、２．５％イソフルランおよび流量２Ｌ／分の搬送ガスとしての酸素によって麻酔された。 動物管理プロトコルに従って、イメージングプロセスおよび回復後の期間中、マウスを注意深く監視しました。 実験グループは n = 3 匹のマウスで構成されました。 4T1 マウス乳がん細胞と CT26 結腸がん細胞をマウスの両後肢に接種すると、数日後に同系の 4T1 腫瘍と CT26 腫瘍が増殖しました。 動物実験は、腫瘍が約 15 mm3 に達したときに行われました。 スタンフォード大学の実験動物管理管理パネル (APLAC) のガイドラインによれば、1 つまたは 2 つの腫瘍を有するマウスの最大許容腫瘍サイズは 2.46 cm3 および 2.5 cm3 でした。 動物は、イソフルラン導入（流量 2 L/min、キャリングガスとして 3 ～ 5% のイソフルランと酸素）を使用して人道的に安楽死させ、続いて頚椎脱臼を行った。

NIR-II ウィンドウでの動物実験とイメージングは​​、2 次元の水冷 640 × 512 InGaAs アレイ (Ninox 640、Raptor Photonics) で実施されました。 クラスターは、70 mW/cm2 の出力密度で 808 nm 連続波ダイオード レーザーによって励起されました。 特に明記しない限り、すべてのイメージング実験では 1100 nm ロングパス フィルターを使用しました。 蛍光プローブは、尾静脈（静脈内、iv）、尾根部（皮下、sc）および（周囲）腫瘍内（it）を介して投与されました。 NIR-II 蛍光画像は、感染後 3 分、10 分、30 分、1 時間、3 時間、6 時間、24 時間、48 時間後に記録されました。

プローブの体内分布は、投与後 10 分、30 分、24 時間、または 48 時間後に分析されました。 尿、糞便、および肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓を含む主要臓器を収集し、硝酸 (68%) で 12 時間消化しました。 その後、無色透明の溶液が得られるまで、溶液を蒸解溶液 (硝酸:過酸化水素 = 4:1) 中で 150 °C に加熱しました。 各サンプル中の金の濃度は、ICP-MS (Thermo Scientific ICAP 6300 Duo View Spectrometer) によって測定されました。

LabView2009 ソフトウェア パッケージは、動物の画像化、ビデオの記録、レーザー照射の同期制御に使用されました。 生の画像は、ImageJ 2.1 を使用して処理および分析されました。 クラスター構造の結晶学的表現は、参考文献 46 で公開されている結晶構造データに基づいて、UCSF Chimera プログラム (バージョン 1.12) を使用して作成されました。

グラフは、Origin 2021 ソフトウェア パッケージを使用して作成されました。 統計分析は、Origin で利用可能なペア比較アプリを使用して実行されました (平均比較方法: Tukey、片側)。 <0.05 の P 値は統計的に有意であるとみなされました。 エラーバーは、3 回繰り返された実験の標準偏差 (SD) を表しました。 データは平均値±SDとして示されています。 サンプルサイズは、リンパ節イメージングに関する動物実験の広範な経験に基づいて選択されました。 各実験は少なくとも 3 回繰り返されました。 マウスはケージからランダムに選択され、研究グループに分けられました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究結果を裏付けるデータは、記事内、補足情報、およびソース データ ファイルから入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。 生の質量分析データはパブリック リポジトリ (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20445561.v1) にあります。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

ザホール、S.ら。 乳がんにおけるセンチネルリンパ節生検：臨床レビューと最新情報。 J. Breast Cancer 20、217–227 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Hamdy, O.、Farouk, O.、El-Badrawy, A.、Denewer, A.、Setit, A. 乳がんにおけるセンチネルリンパ節生検 - 概要の更新。 ユーロ。 外科。 - Acta Chirurgica Austriaca 52、268–276 (2020)。

記事 Google Scholar

マーシャル、M.V et al. インドシアニン グリーンを使用したヒトの近赤外蛍光イメージング: レビューと最新情報。 オープンサージ。 オンコル。 J. 2, 12–25 (2010)。

Pan, J. et al. OSCC患者におけるICGベースの近赤外蛍光イメージングによる手術断端のリアルタイム監視。 World J. Surg. オンコル。 18、96 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ヤン、Ｈら。 微小血管皮弁手術の周術期ガイド用に改造されたアクション カメラを使用した手持ち式近赤外蛍光イメージング デバイス。 Ｊ．クリン． 医学。 10、1–12 (2021)。

Google スカラー

横山純 ほか口腔がんにおけるicg蛍光ナビゲートセンチネルリンパ節生検の長期追跡多施設実現可能性研究。 モル。 クリン。 オンコル。 13、1–8 (2020)。

記事 Google Scholar

ファン・デル・フォルスト、JR 他頭頸部がん患者の口腔の近赤外蛍光センチネルリンパ節マッピング。 オーラル。 オンコル。 49、15–19 (2013)。

論文 PubMed Google Scholar

Zhang、C.ら。 切除されたヒト組織の乳がんを視覚化するためのメチレンブルーベースの近赤外蛍光イメージング。 Technol Cancer Res Treat 18、1533033819894331 (2019)。

タマーズ、QRJG et al. メチレンブルーを使用した傍神経節腫の術中の近赤外蛍光イメージング: 症例報告。 内部。 Ｊ．Ｓｕｒｇ． 判例報告書 6、150–153 (2015)。

記事 Google Scholar

Dogan , NU 、 Dogan , S. 、 Favero , G. 、 Köhler , C. & Dursun, P. センチネルリンパ節生検の基本: 解剖学的および病態生理学的考察と臨床的側面。 Ｊ．オンコル． 2019 年 1 ～ 10 日 (2019 年)。

モンカヨ、VM、アールスヴォルド、JN、アラズラキ、NP リンパシンチグラフィーおよびセンチネルリンパ節。 Ｊ．Ｎｕｃｌ． 医学。 改訂 56、901–907 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Vidal-Sicart, S. & Valdés Olmos, R. がん患者の予後ツールとしてリンパシンチグラフィーを使用する。 解像度 Nucl議員。 医学。 1、s64945 (2016)。

Chahid, Y.、Qiu, X.、van de Garde, EMW、Verberne, HJ & Booij, J. 乳がん患者のリンパシンチグラフィーにおけるセンチネルリンパ節の非可視化の危険因子。 EJNMMI Res. 11、54 (2021)。

ジェレミアッセ、B. et al. 腫瘍患者のセンチネルリンパ節を特定するための蛍光剤を使用した近赤外イメージングに関する系統的レビューとメタ分析。 ユーロ。 J. Surgical Oncol. 46、2011–2022 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Ballardini、B. et al. インドシアニン グリーン法は、乳がんのセンチネルリンパ節を特定するための 99mTc 標識放射性トレーサー法と同等です: 一致および検証研究。 ユーロ。 J. Surgical Oncol. 39、1332–1336 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Kim、JH、Ku、M.、Yang、J.、Byeon、HK 口腔がんにおける ICG ガイド下センチネルリンパ節マッピングの最近の開発。 診断 11、891 (2021)。

ウェルシャー、Ｋ．ら。 マウスの近赤外線イメージングのための高輝度蛍光カーボン ナノチューブへの道。 ナット。 ナノテクノロジー。 4、773–780 (2009)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホン、G.ら。 新しい近赤外線窓での脳の頭蓋骨透過蛍光イメージング。 ナット。 フォトニクス 8、723–730 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang、F.ら。 In vivo NIR-II 構造化照明ライトシート顕微鏡。 手順国立アカド。 科学。 USA 118、e2023888118 (2021)。

Bruns、OT et al. 短波長赤外量子ドットを用いた次世代の生体内光学イメージング。 ナット。 バイオメッド。 エンジニア。 1,0056 (2017)。

Wang、F.ら。 超伝導ナノワイヤ単一光子検出器を使用した、1700 nm を超える in vivo 非侵襲的共焦点蛍光イメージング。 ナット。 ナノテクノロジー。 17、653–660 (2022)。

Wang、F.ら。 近赤外 II 窓でのライトシート顕微鏡検査。 ナット。 方法 16、545–552 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

スー、JCら。 X 線イメージング用途向けのナノ粒子造影剤。 Wiley Interdisciplinary Rev.: Nanomed。 ナノバイオテクノロジー。 12、e1642 (2020)。

フォルテ、E.ら。 腫瘍イメージング用の放射性標識された PET/MRI ナノ粒子。 Ｊ．クリン． 医学。 9、89 (2020)。

Upputuri, PK & Pramanik, M. 2 番目の近赤外線ウィンドウでの光音響イメージング: レビュー。 Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． オプション。 24、1 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

張、N.-N. 他。 生物学的検出のための近赤外 II イメージング技術の最近の進歩。 Ｊ．ナノバイオテクノロジー． 19、132（2021）。

ヤン、RQら。 近赤外 II 蛍光イメージングによる悪性腫瘍の手術ナビゲーション。 Small Methods 5、2001066 (2021)。

ワン、P.ら。 高効率のNIR II蛍光バイオイメージング誘導卵巣腫瘍手術のための、卵胞刺激ホルモンペプチド製造によるナノプローブのダウンシフト。 Nanomed.: ナノテクノロジー。 バイオル。 医学。 28、102514 (2020)。

周、H.ら。 骨肉腫および肺転移の特異的小分子NIR-II蛍光イメージング。 上級ヘルスケアマット。 9、e1901224 (2020)。

Jacques, SL 生物組織の光学的特性: レビュー。 医学と生物学における物理学 58、R37–R61 (2013)。

Diao, S. et al. 2番目の近赤外領域での自家蛍光を伴わない生体イメージング。 ナノ解像度。 8、3027–3034 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

リー、Ｙら。 分子および形態学的レベルでの構造変調による近赤外 IIb イメージングのための AIEgens の設計。 ナット。 共通。 11,1255 (2020)。

Tian、R.ら。 リンパ節浸潤がんの検出および画像誘導手術用の多重化 NIR-II プローブ。 上級マット。 32、e1907365 (2020)。

アンデルセン、CK et al。 カーボン ナノチューブ - 関節リウマチにおける標的薬物送達のための強力なキャリア。 薬学 13、453 (2021)。

Ma、Z.ら。 ナノセラロスティック用途における迅速な排泄のための架橋機能化ナノ粒子。 アンジュー。 化学。 - 国際エド。 59、20552–20560 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Zhong、Y.ら。 超高輝度近赤外 IIb 希土類ナノ粒子を使用した免疫療法のための in vivo 分子イメージング。 ナット。 バイオテクノロジー。 37、1322–1331 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ファン、Y. 他生涯設計された NIR-II ナノ粒子により、多重化された in vivo イメージングが可能になります。 ナット。 ナノテクノロジー。 13、941–946 (2018)。

Ma、Z.ら。 動的組織灌流測定と高空間分解能による血管再生の近赤外 IIb 蛍光イメージング。 上級楽しい。 マット。 28、(2018)。

Zhang、XD et al. 分子蛍光団を使用した 2 番目の近赤外線ウィンドウでの外傷性脳損傷のイメージング。 上級メーター。 28、6872–6879 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang, S. et al. オボアルブミンカプセル化によるタンデム活性酸素種生成による相乗的抗がん療法。 アンジュー。 化学。 - 国際エド。 59、20008–20016 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

アンタリス、アラバマ州ら。 NIR-II イメージング用の小分子色素。 ナット。 メーター。 15、235–242 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Chakraborty, I. & Pradeep, T. 貴金属の原子的に正確なクラスター: 原子とナノ粒子間の新たなつながり。 化学。 改訂 117、8208–8271 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jin, R.、Zeng, C.、Zhou, M. & Chen, Y. 原子的に正確なコロイド金属ナノクラスターとナノ粒子: 基礎と機会。 化学。 改訂 116、10346–10413 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Du、B.ら。 糸球体バリアは、サブナノメートル領域で原子レベルで正確なバンドパス フィルターとして機能します。 ナット。 ナノテクノロジー。 12、1096–1102 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, J.、Zhang, C. & Dickson, RM 高蛍光性、水溶性、サイズ調整可能な金量子ドット。 物理学。 レット牧師。 93、(2004)。

Zhu, M.、Eckenhoff, WT、Pintauer, T. & Jin, R. 陰イオン [Au 25 (SCH 2 CH 2 Ph) 18] − 空気酸化によるクラスターから電荷中性クラスターへの変換。 Ｊ．Ｐｈｙｓ． 化学。 C. 112、14221–14224 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Aikens、CM 原子的に正確なチオラート安定化貴金属ナノクラスターにおける電子的および幾何学的構造、光学的特性、および励起状態の挙動。 準拠化学。 解像度 51、3065–3073 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Taylor, MG & Mpourmpakis, G. リガンドで保護された金属ナノクラスターの熱力学的安定性。 ナット。 共通。 8、(2017)。

のんっぱ。 バイオイメージング用途向けの発光金ナノクラスター。 Beilstein J. Nanotechnol 11、533–546 (2020)。

Xiao, Y.、Wu, Z.、Yao, Q. & Xie, J. 発光金属ナノクラスター: バイオセンシング戦略とバイオイメージングの応用。 集計 2、114–132 (2021)。

記事 Google Scholar

ヴァン・デ・ローイ、SM 他金ナノクラスター: 生物医学応用におけるイメージング、治療、およびセラノスティックの役割。 バイオコンジュゲート Chem. 33、4–23 (2022)。

Liu、H.ら。 NIR-II イメージング用の原子精度の金クラスター。 上級マット。 31、(2019)。

Li、Q.、Zeman、CJ、Ma、Z.、Schatz、GC & Gu、XW 棒状正二十面体金ナノクラスターにおける明るい NIR-II フォトルミネッセンス。 小17、(2021)。

Zhang、C.ら。 腫瘍内での優れた浸透および保持挙動を備えた、蛍光イメージングと標的光力学療法を同時に行うための金ナノクラスターベースのナノプローブ。 上級機能。 メーター。 25、1314–1325 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

リー、D.ら。 骨のNIR-II蛍光イメージング用の金ナノクラスター。 小16、(2020)

ソング、Ｘら。 In Vivo 腫瘍標的イメージング用の新しいクラスの NIR-II ゴールド ナノクラスターベースのタンパク質バイオラベル。 アンジュー。 化学。 - 国際エド。 60、1306–1312 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Wang, Q. et al. 体液中の C 反応性タンパク質を選択的に捕捉するための生体模倣ポリマーベースの方法。 ACS アプリケーション。 メーター。 インターフェイス 10、41999 ～ 42008 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jiang, C.、Alam, MT、Parker, SG、Darwish, N. & Gooding, JJ アリールジアゾニウム塩を使用して修飾電極上の 2 つの異なる成分の表面積比の制御を達成する戦略。 ラングミュア 32、2509–2517 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

藤原直樹 ほか 2-メタクリロイルオキシエチル ホスホリルコリン (MPC) ポリマーは口腔細菌の増加を抑制します: 単盲検クロスオーバー臨床試験。 クリン。 オーラル。 調査します。 23、739–746 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Qi、M.ら。 インターロイキン 6 の生体内モニタリング用のナノサンドイッチ デバイスに統合された 2 つの機能を備えた酸化グラフェン薄膜。 ACS アプリケーション。 メーター。 インターフェイス 9、41659–41668 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ダガタ、R. 他表面プラズモン共鳴によるヒト血漿サンプル分析用の新しい超低汚れ表面。 タランタ 221、(2021)。

Katla, SK、Zhang, J.、Castro, E.、Bernal, RA & Li, X. 原子的に正確な Au25(SG)18 ナノクラスター: 高速シングルステップ合成と光熱療法への応用。 ACS アプリケーション。 メーター。 インターフェース 10、75–82 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dorion, S.、Ouellet, JC & Rivoal, J. ストレス下の植物におけるグルタチオン代謝: 活性酸素種の解毒を超えて。 代謝物 11、641 (2021)。

スタロソルスキー、Z.ら。 2 番目の近赤外 (NIR-II) ウィンドウでのインドシアニン グリーン蛍光。 PLoS ONE 12、(2017)。

Li, X.、Fu, Y.、Ma, L.、Wang, Z. & Zhang, H. インドシアニン グリーンとヒト血清アルブミンの相互作用に関する分光分析研究。 化学。 解像度顎。 大学 32、343–347 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Chen, S.、Zheng, J.、Li, L. & Jiang, S. タンパク質吸着に対するホスホリルコリン自己集合単層の強い耐性: 両性イオン材料の非汚染特性についての洞察。 混雑する。 化学。 社会 127、14473–14478 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

篠原直也 ほか気管内注入後のラット肺における未加工の多層カーボンナノチューブの長期保持。 Ｊ．Ａｐｐｌ． 有毒。 36、501–509 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウー、F.ら。 皮下注射後のマウスにおけるタンパク質のリンパ節取り込みの蛍光イメージング: 分子量依存性。 薬局。 Res 29、1843 ～ 1853 年 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zeng、HC、Hu、JL、Bai、JW、Zhang、GJ 悪性腫瘍における近赤外画像によるセンチネルリンパ節の検出。 モル。 イメージングバイオル。 21、219–227 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リン、J.ら。 乳がんにおけるセンチネルリンパ節生検のためのインドシアニングリーン蛍光法。 アジアの J. Surg. 43、1149–1153 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Kang, X. & Zhu, M. 原子的に正確なナノクラスターのフォトルミネッセンスを調整する。 化学。 社会改訂 48、2422–2457 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhou, M. & Song, Y. [Au25(SR)18] ナノクラスターにおける可視および近赤外線放射の起源。 Ｊ．Ｐｈｙｓ． 化学。 レット。 12、1514–1519 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Xia、N.ら。 金ナノ粒子で明らかになった構造振動。 混雑する。 化学。 社会 142、12140–12145 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pyo, K. et al. 金ナノクラスターからの超高輝度発光: Au(I)-チオラートシェルの硬化。 混雑する。 化学。 社会 137、8244–8250 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Li、Q.、Zeman、CJ、Schatz、GC、Gu、XW 金ナノクラスターの明るい近赤外発光源。 ACS Nano 15、16095–16105 (2021)。

Negishi, Y.、Nobusada, K. & Tsukuda, T. グルタチオン保護金クラスターの再考: 金(I)-チオラート錯体とチオラート保護金ナノ結晶間のギャップの橋渡し。 混雑する。 化学。 社会 127、5261–5270 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヤギーニ、E.ら。 重金属を含まない量子ドットを使用した in vivo 生体内分布研究および ex vivo リンパ節イメージング。 バイオマテリアル 104、182–191 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チョイ、HSら。 光学イメージングを向上させるための、ターゲットを絞った双性イオン性近赤外蛍光色素。 ナット。 バイオテクノロジー。 31、148–153 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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AB は、スイス国立科学財団 (早期ポスドク モビリティ、助成金 P2GEP2_191466) からの財政的支援を認めています。 この研究は、国立衛生研究所 NIH DP1-NS-105737 からも支援されました。 AB は、スタンフォード動物組織学サービス (AHS) と HistoTek による組織切片の H&E 染色、スタンフォード診断ラボによる血液分析と細胞株検査の支援に感謝します。 AB は、スタンフォード大学質量分析サービスと ESI-MS 分析に対する Theresa McLaughlin に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Ani Baghdasaryan、Feifei Wang。

スタンフォード大学化学およびバイオ X 学部、スタンフォード、カリフォルニア州、94305、米国

アニ・バグダサリアン、フェイフェイ・ワン、フーチアン・レン、ジューオラン・マー、ジアチェン・リー、チュン・シュー、ホンジエ・ダイ

スタンフォード大学工学部生物工学科、スタンフォード、カリフォルニア、94305、米国

周雪庭

免疫学・移植・感染症研究所、スタンフォード大学医学部、病理学教室、微生物学・免疫学科、スタンフォード、カリフォルニア州、94305、米国

リリット・グリゴリアン

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HD と AB が実験を考案し、設計しました。 AB と FW が実験を実行しました。 AB、FW、FR、ZM、JL、XZ、LG、CX、HD がデータを分析しました。 ABとHDが原稿を書きました。 著者全員が原稿の一般的な議論と改訂に貢献しました。

戴宏傑さんへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Xiaodong Zhang 氏、Jie Zheng 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Baghdasaryan、A.、Wang、F.、Ren、F. 他。 ホスホリルコリン結合金分子クラスターは、前臨床癌モデルにおけるリンパ節 NIR-II 蛍光イメージングの信号を改善します。 Nat Commun 13、5613 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33341-6

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受信日: 2022 年 1 月 20 日

受理日: 2022 年 9 月 13 日

公開日: 2022 年 9 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33341-6

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