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Jul 10, 2023

動的核分極

Rapporti scientifici Volume 6,

Scientific Reports volume 6、記事番号: 21407 (2016) この記事を引用

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メトリクスの詳細

水溶性の高いユビキノン-0 (CoQ0) はアスコルビン酸モノアニオン (Asc) と反応して、アスコルビル フリー ラジカル (AFR) の生成を仲介します。 CoQ0 と Asc の水性反応混合物を使用して、電子スピン共鳴 (ESR) 照射の低周波数 (515 ～ 530 MHz の範囲) で AFR の積極的に増強された動的核分極 (DNP) 磁気共鳴 (MR) 画像を取得しました。 測定された DNP スペクトルの形状は、二重線スペクトル ピークを持つ ESR 吸収スペクトルに類似していました。 AFR (520 および 525 MHz)、14N 標識カルバモイル-PROXYL (14N-CmP) (526.5 MHz) および Oxo63 (522 MHz) 間の DNP スペクトルにおけるスペクトル ピークの相対的な位置関係は、X-帯域の ESR スペクトルですが、300 MHz ESR スペクトルと同様でした。 AFRのラジカル濃度に対するDNP増強の比は、14N-CmP、Oxo63、およびフラビンセミキノンラジカルの比よりも高かった。 AFRについて観察された分光学的DNP特性は、ピロロキノリンキノンによって媒介されるAFRのものと本質的に同じでした。 さらに、イメージングプローブとして皮下注射および経口注射によって投与されたCoQ0媒介AFRのin vivo DNP-MRイメージングに成功しました。

アスコルビン酸塩は、栄養素（ビタミンC）としてだけでなく、強力な還元剤であるため抗酸化剤としても広く使用されています。 アスコルビン酸塩とデヒドロアスコルビン酸塩の間の代謝反応は、生体内での酸化還元状態の影響を受けます。 最近、核磁気共鳴（NMR）分光法による同位体（1-13C）分子の過分極技術を臨床応用のための生体内酸化還元状態のモニタリングに使用することが提案されています1,2。 一方、アスコルビルフリーラジカル（AFR）は、カルボニル基を有する構造部分に不対電子が局在していないモノアニオン型であり、アスコルビン酸モノアニオン（Asc）の一電子酸化により生成されます3。 Asc は、酸化ストレスに関与するスーパーオキシドアニオン ラジカル 4、一酸化窒素 5、ビタミン E ラジカル 6,7 と反応して AFR を生成します。 したがって、AFR は、生体内酸化還元マーカーとして酸化ストレスをモニタリングできる可能性もあり、通常のビタミン C 分子（同位体標識なし）を使用できる利点があります。 AFR の検出には、X バンド ESR 分光法などの高 ESR 周波数での電子スピン共鳴 (ESR) 分光法が頻繁に使用されており 8、UV 吸収の分光光度測定も報告されています 9。 内因性 AFR の in vitro 研究は、X バンド ESR 分光検出を使用して実施されています 10,11。 高周波による ESR 分光法は、微量のフリーラジカルに対して高い感度を持っていますが、生体内検出ではマイクロ波が体内に浸透するという欠点があります 12,13。

低 ESR 照射周波数での動的核分極 (DNP) 磁気共鳴 (MR) イメージングは​​、フリーラジカルの新しい in vivo イメージング法として開発されました 14。 この画像化方法は、フリーラジカルの画像が高強度、高解像度、鮮明なエッジを備えているため、体内のフリーラジカルの正確な解剖学的位置に関する正確な情報を提供できます15。 最近では、pH またはレドックス感受性のニトロキシド 16,17,18,19 や酸素またはスーパーオキシド感受性の Oxo6320,21,22 (トリアリールメチルラジカル) などの化学合成フリーラジカルをイメージングプローブとして使用し、in vivo DNP-MR を実現しています。画像処理は、酸化還元状態 23,24、腫瘍内の酸素濃度 25,26、胃の pH レベル 27、ミトコンドリア機能 28 を調査するために使用されています。 一方、兵藤らは、 らは以前、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、フラビンアデニンジヌクレオチド、α-トコフェロール、ビタミンK1、ユビキノン-10[酸化型コエンザイムQ10（CoQ10）]などの生物学的に不可欠な分子のフリーラジカル中間体のin vitro分光DNP-MRイメージングを報告している29。 報告されているフラビン セミキノン ラジカルの水性サンプルは、in vivo イメージング プローブの最も可能性の高い候補であると思われます。

低い ESR 照射周波数での DNP-MR イメージングは​​、酸化ストレス誘発性の疾患や傷害の評価など、前臨床および臨床応用のための AFR の非侵襲的でリアルタイムの in vivo イメージングの可能性を秘めています 30。 AFR の in vivo DNP-MR イメージングのためには、AFR の DNP 特性を理解する必要があります。 しかし、これまでのところ、AFR の DNP 特性に関する報告はありません。 さらに、ニトロキシドおよび Oxo63 (おそらくフラビン セミキノン ラジカルも) と AFR の DNP-MR イメージングを組み合わせることにより、疾患の評価に多面的なアプローチを提供できる可能性があります。 この使用法を考慮しても、AFR とよく知られているフリーラジカルとの間の DNP 特性の類似点と相違点を明確にすることが重要です。

AFR の DNP-MR イメージングにアプローチするために、我々は Asc 分子とキノン分子の間の酸化還元サイクリング反応で生成される AFR に焦点を当てました 31。 極めて水溶性の高いユビキノン-0 [コエンザイム Q0 (CoQ0) の酸化型] は、水溶液中での AFR の生成を高度に媒介できることが報告されています 32,33。 最初に、AFRの分光学的DNP特性を調べるためにCoQ0媒介AFRを水性AFRサンプルのモデルとして選択し、大量のAFRを生成するために濃度を変更することによってAscとCoQ0の水性混合物を最適化しました（図S-1）。 1250 mM Asc と 12.5 mM CoQ0 の水性混合物により、十分な量と化学的安定性を備えた AFR が得られ (図 S-2)、低 ESR 照射頻度 (515 –530MHz）。

Asc と CoQ0 のこの水性混合物を使用して、さまざまな ESR 照射周波数で CoQ0 媒介 AFR の DNP-MR イメージングを実行し、AFR の DNP スペクトルを決定し、この DNP スペクトルを X バンド、L バンドのそれぞれと比較しました。 AFR の 300 MHz ESR スペクトル。 さらに、CoQ0 媒介 AFR の DNP-MR イメージングに対する ESR 照射の出力と持続時間の影響を調べました。 ここでは、CoQ0媒介AFRのDNP特性に関する基本的な分光法を報告し、Ascとピロロキノリンキノン（PQQ）の同様の型の反応、およびAscとTroloxラジカルの異なる型の反応で生成されるAFRの分光法と比較して議論します。 さらに、マウスに皮下または経口投与されたCoQ0媒介AFRのin vivo DNP-MRイメージングを実証します。

2500 mM アスコルビン酸ナトリウム (pH 7) と 25 mM CoQ0 (pH 3.5) の水溶液を等量混合し、1250 mM Asc と 12.5 mM CoQ0 の混合物を調製しました。 図1aに示すように、この混合物のXバンドESRスペクトルは、CoQ0のセミキノンラジカルの顕著な生成がなく、AFRに対する特定のダブレットスペクトルの顕著な増加を示しました。 混合後 60 秒で記録されたこのダブレット AFR スペクトルの測定では、そのシグナル強度は 1250 mM アスコルビン酸ナトリウム水溶液中の元の AFR のシグナル強度よりも 17 倍高かった（図 1b）。 Asc と CoQ0 の混合物の AFR 濃度と pH 値は、混合後 30 から 105 秒の間に、それぞれ 25 から 10 μM (図 1c) と 8.4 から 8.0 (図 S-2d) に減少しました。 DNP-MRイメージングのスキャン時間に影響します。 Asc と CoQ0 の混合物および 1250 mM Asc 溶液の DNP-MR イメージングを、515 ～ 530 MHz の範囲のさまざまな ESR 照射周波数で実行しました (図 S-5)。 これらのサンプルのDNP-MR画像の強度をESR照射周波数に対してプロットして、図1dに示すDNPスペクトルを取得します。 CoQ0 媒介 AFR の DNP スペクトルは、X バンド ESR 吸収スペクトルの AFR スペクトルに似た明確なダブレット形状を持ち、画像は 518.5 ～ 526.5 MHz の範囲で積極的に強調されており、518.5 ～ 526.5 MHz の範囲で 2 つのピークが示されています。 520 MHz と 525 MHz で、517.5 MHz と 527.5 MHz およびその近傍で負に強調されます。 CoQ0媒介AFRのDNP-MR画像の520および525 MHzのスペクトルピークの強度は、ESR照射なしで得られた画像（DNP OFF）の4倍でした（図1e、f）。 1250 mM Asc 溶液の DNP スペクトルは、520 MHz および 525 MHz およびこれらの近傍でわずかに負の増強を示しています。

CoQ0 媒介 AFR の DNP スペクトル。

(a) 12.5 mM CoQ0 溶液、1250 mM Asc 溶液、および 1250 mM Asc と 12.5 mM CoQ0 の混合物の典型的な X バンド ESR スペクトル。 (b) Asc 溶液 (点線) および Asc と CoQ0 の混合物 (実線) の X バンド ESR 吸収スペクトル。 (c) Asc と CoQ0 の混合物の AFR 濃度とスペクトル ピークでのシグナル強度 (挿入図) の時間変化。 (d) Asc 溶液 (白丸) および Asc と CoQ0 の混合物 (黒丸) の DNP スペクトル。 Asc と CoQ0、Asc と CoQ0、および超純水の混合物の DNP-MR 画像 (e) および画像強度のグラフ (f)。 (a) では、混合後 60 秒でダブレットスペクトルが記録されました。 (b) では、(a) に示したスペクトルを積分することで吸収スペクトルが得られます。 (c) では、横軸はダブレットスペクトルが記録された時刻を示します。 データは平均値 ± SD (n = 6) です。 (f) では、データは平均 ± SD (n = 6、*スチューデントの t 検定によって決定された P < 0.001) です。

CoQ0 媒介 AFR の DNP スペクトルを 14N-CmP および Oxo63 の DNP スペクトルと比較するために、CoQ0 媒介 AFR、150 μM 14N-CmP および 60 μM Oxo63 の DNP-MR 画像を 1 回の ESR 照射周波数で同時に取得しました。 515 ～ 530 MHz の範囲 (図 S-6)。 これらのサンプルのXバンドESRおよびDNPスペクトルをそれぞれ図2a、bに示します。 ESR スペクトルの一部と、FMN セミキノン ラジカル (FMNH) サンプル (9 mM FMN と 9 mM NADH の水性混合物) のさまざまなピーク位置での画像強度を示す 4 つのプロットも示されています (図 S-7)。 CoQ0 媒介 AFR のダブレット スペクトル ピーク (520 および 525 MHz) と 14N-CmP (526.5 MHz) および Oxo63 (522 MHz) の中心スペクトル ピークの間の相対的な位置関係は、X-バンドESR吸収スペクトル。

CoQ0 媒介 AFR、14N-CmP、および Oxo63 の DNP スペクトル。

XバンドESR吸収スペクトル（a）、DNPスペクトル（b）、代表的なDNP-MR画像（c）、およびさまざまなESR照射パワー（c）およびTESR（d）で得られたDNP-MR画像の強度の変化、 1250 mM Asc と 12.5 mM CoQ0 の混合物 (赤色)、150 μM 14N-CmP (青色) および 60 μM Oxo63 (緑色) 溶液、および 9 mM FMN と 9 mM NADH の混合物 (オレンジ) の場合。 (a) では、混合後 60 秒後にダブレットスペクトルが記録されました。 FMN と NADH の混合物の場合、(a) には ESR 吸収スペクトル (図 S-7b) の一部が示され、(b) には画像強度のプロット (図 S-7d) が図 S-6b に重ねられます。 。 (c) の画像は図 S-6a からのものです。 1250 mM Asc と 12.5 mM CoQ0 (赤)、150 μM 14N-CmP (青) および 60 μM Oxo63 (緑色) 溶液と 9 mM FMN と 9 mM NADH の混合物 (オレンジ)。

CoQ0 媒介 AFR、14N-CmP、Oxo63、および FMNH に対する ESR 照射のパワーの効果を比較するために、スペクトル ピークの各 ESR 周波数で 5 W までのさまざまな ESR 照射パワーで DNP-MR 画像を取得しました。図2bで使用したサンプルを使用し、これらの画像強度をESR照射パワーに対してプロットしました（図2d）。 CoQ0 媒介 AFR の画像強度は、出力が上昇するにつれて曲線を描いて増加し、3 W 付近で飽和しました。このような出力依存性の AFR の飽和は、ESR 分光法でも観察されました 34。 CoQ0 媒介 AFR の DNP-MR イメージングの出力依存曲線は、Oxo63 の曲線と類似しています。 AFRの画像強度は、14N-CmPやFMNHと比較して、ESR照射の低出力では飽和しました。 これらのサンプルのパワー依存性の違いは、スペクトル幅とラジカル濃度の違いによって引き起こされる可能性があります (表 1)。 ダブレット AFR スペクトルの各スペクトルの半値幅は、60 μM Oxo63 の半値幅とほぼ等しく、150 μM 14N-CmP の半値幅の半分です。 また、これらのサンプルについて、0.2〜0.9秒の範囲のさまざまなTESRでDNP-MR画像を取得しました（図2e）。 すべてのサンプルの画像強度は、TESR が上昇するにつれて同様の方法で直線的に増加しました。

CoQ0 媒介 AFR、14N-CmP、および Oxo63 の X バンドおよび DNP スペクトルにおけるスペクトル ピークの相対的な位置関係の違いを調べるために、L バンド (~1000 MHz) および 300 MHz ESR スペクトルを測定しました。これらの水性サンプルについて、ESR 照射 (515 ～ 530 MHz) に近い ESR 周波数で取得され、これらのスペクトルを X バンド ESR スペクトルと比較しました (図 3)。 これらの ESR 分光法における CoQ0 媒介 AFR のすべてのスペクトルは、約 100 メートルの同じ距離を示しました。 ダブレットスペクトルの 2 つのピークの間は 0.18 mT。 この 2 つのピークと 14N-CmP 溶液の中心スペクトル ピークの間の距離は、X バンド ESR スペクトルではそれぞれ 0.05 および 0.13 mT、L バンド ESR スペクトルでは 0.02 および 0.16 mT でした。 L バンド ESR スペクトルは、14N-CmP および Oxo63 溶液に対するダブレット AFR スペクトルのピーク位置が、X バンド ESR スペクトルに比べて高磁場側にシフトしていることを示しました。 300 MHz ESRスペクトルでは、より顕著な変化が見られました。

CoQ0 媒介 AFR、14N-CmP、および Oxo63 の X バンド、L バンド、および 300 MHz ESR スペクトル。

1250 mM Asc と 12.5 mM CoQO、14N-CmP、および Oxo63 溶液の混合物の X バンド (a)、L バンド (a) および 300 MHz (b) ESR 吸収スペクトル。 14N-CmPおよびOxo63溶液の濃度は、(a)および(b)ではそれぞれ100および10μM、(c)では200および50μMであった。 これらの吸収スペクトルは、図 S-3 に示すスペクトルを積分することで得られます。 (c)では、AFRダブレットスペクトルのスペクトルピークが矢印で示されています。

これらの ESR スペクトル測定では、ESR 周波数の範囲が低くなるにつれて、ダブレット AFR スペクトルのピーク位置は、14N-CmP および Oxo63 のピーク位置と比較して、より高い磁場側にシフトしました。 この相対的なスペクトルシフトの原因についてはほとんどわかっていませんが、ナイトシフトを引き起こす超微細相互作用の違いに関連している可能性があります 35。 これらの観察は、14N-CmP および Oxo63 に対するダブレット AFR スペクトルのピーク位置が ESR 周波数に依存することを示唆しています。 この示唆と一致して、CoQ0 媒介 AFR、14N-CmP、および Oxo63 の間の 515 ～ 530 MHz の範囲の DNP スペクトルのスペクトル ピークの相対的な位置関係は、300 MHz ESR スペクトルの相対位置関係と類似していました。 L バンド ESR スペクトルではなく。

CoQ0媒介AFRのダブレットスペクトルピークの画像強度は、150μM 14N-CmPおよび60μM Oxo63の中央スペクトルピークの画像強度、および525MHzのFMNHサンプルの画像強度とほぼ同等です（図2b）。 これらのサンプルの DNP 増強係数を決定しました (表 1)。 DNP 強調係数 ε は、ε = Iz/I0 として定義されます。ここで、Iz と I0 は、兵藤らによる以前のレポートで説明されているように、それぞれ ESR 照射ありとなしの画像強度です。 これらのサンプルの中で、CoQ0 媒介 AFR は、ラジカル濃度に対する増強因子の比の値が最も高かった。

別の高水溶性キノン分子 38 である PQQ36,37 は、抗酸化物質 39 および活性酸素種のスカベンジャー 40 として機能する新規ビタミン様生物因子です。 2500 mM アスコルビン酸ナトリウム水溶液と 30 mM ピロロキノリンキノン二ナトリウム水溶液（NaOH と HCl 溶液で pH 5 に調整）を体積比 17:3 で混合し、2125 mM Asc と 4.5 mM PQQ の混合物を調製しました。 この混合物のXバンドスペクトルは、AFRを示すダブレットスペクトルの顕著な増加を示しました（図4a）。 混合後60秒で記録されたこのダブレットAFRスペクトルの測定では、そのシグナル強度は、2125mMアスコルビン酸ナトリウム水溶液中の元のAFRのシグナル強度よりも5.7倍大きかった（図4b）。 Asc と PQQ のこの混合物は、我々のシステムによる in vitro DNP-MR イメージングを可能にするのに十分な量と化学的安定性を備えた AFR も与えました (図 S-8)。

PQQ 媒介 AFR、14N-CmP、および Oxo63 の DNP スペクトル。

(a) 2125 mM Asc と 4.5 mM PQQ の混合物、2125 mM Asc 溶液と 4.5 mM PQQ 溶液の典型的な X バンド ESR スペクトル。 (b) Asc 溶液 (点線) および Asc と PQQ の混合物 (実線) の X バンド ESR 吸収スペクトル。 Asc および PQQ (赤色)、90 μM 14N-CmP (青色)、および 50 μM Oxo63 (緑色) 溶液の混合物の X バンド ESR 吸収 (c) および DNP スペクトル (d)。 （ e ）ESR照射なし（DNP OFF）、または2125 mM Ascと4.5 mM PQQ、2125 mM Ascと4.5 mM PQQ溶液および超純水の混合物に対する525および520 MHzの周波数でのESR照射ありの代表的なDNP-MR画像。 (f) (e)のDNP-MR画像の強度を示すグラフ。 (a) と (c) では、ダブレット スペクトルは混合後 60 秒で記録されました。 (b) では、(a) に示したスペクトルを積分することで吸収スペクトルが得られます。 (f) のデータは平均値 ± SD (n = 3) を表します。

この混合物を使用して、PQQ 媒介 AFR の積極的に増強された DNP-MR 画像が得られました (図 S-9)。 14N-CmPおよびOxo63のものと比較したPQQ媒介AFRのXバンドESRおよびDNPスペクトルのスペクトルピークの位置は、CoQ0媒介AFRのものと同じでした（図4c、d） 。 PQQ媒介AFRのDNP-MR画像は、2125 mM Ascおよび4.5 mM PQQ水溶液を使用して、520および525 MHzのESR照射周波数で、またはESR照射なしで同時に取得されました（図4e）。 これらのDNP-MR画像の強度は、ESR照射なしで得られた画像の強度よりも2.5倍大きかった（図4f）。 PQQ 媒介 AFR の AFR 濃度に対する増強因子の比は、CoQ0 媒介 AFR の比とほぼ同じでした (表 1)。

Trolox ラジカル溶液 (エタノール/18-クラウン-6 溶液) をラジカル濃度約 10 % で混合しました。 AFRを生成するための等量の300μMおよび2500mM Asc水溶液（図5a）。 ＡＦＲ濃度は約２０％であった。 混合後 60 秒で 12 μM。 このAFRのXバンドESRスペクトルの信号強度は、混合後4分間は有意な減少を示さず、4分後に徐々に減少し始め（図5b）、比較的高い化学的安定性を示しました。 この混合物を使用して、AFR の積極的に強化された DNP-MR 画像が得られました。 AFRのXバンドESRおよびDNPスペクトルのスペクトルピークの位置は、キノン媒介AFRのものと同じでした（図5c〜e）。

Asc ラジカルと Trolox ラジカルの反応によって生成される AFR の DNP-MR イメージング。

Trolox ラジカル溶液、2500 mM Asc 溶液、および Trolox ラジカル溶液と 1250 mM Asc 溶液の混合物の典型的な X バンド ESR スペクトル。 XバンドESR吸収スペクトル(a)とダブレットスペクトルの信号強度の時間変化(b)。 Trolox ラジカル溶液と 1250 mM Asc (赤色)、100 μM 14N-CmP (青色)、および 50 μM Oxo63 の混合物の X バンド ESR 吸収 (c) DNP スペクトル (d) および代表的な DNP-MR 画像 (e)緑色）のソリューション。 画像は、累積数が 2 であることを除いて、CoQ0 媒介 AFR と同じ条件で取得されました。

Asc と CoQ0 の混合物をマウスの背中に皮下注射するか、マウスの胃に経口注射した後、525 MHz の ESR 周波数で CoQ0 媒介 AFR の DNP-MR イメージングを実行し、増強された DNP-MR を得ました。図6に示すように、両方の注射におけるCoQ0媒介AFRの画像（上）。これらの画像とDNP OFFで得られた画像を差し引くと、ラジカル画像（下）が得られます。 増強された画像強度は、10 分以内に時間依存的に減少しました。

AFR の in vivo DNP-MR イメージング。

（ a ）AscとCoQ0の水性混合物500μLをマウスの背中に皮下注射した後のマウスのDNP-MR画像の時間変化。 DNP-MR画像は、3Wの出力でESR照射（TR = 500 ms、TE = 40 ms、FA = 90度、TESR = 400 ms）により取得されました。 （ b ）AscとCoQ0の水性混合物500μLをマウスの胃に経口注射した後のマウスのDNP-MR画像の時間変化。 DNP-MR画像は、8Wの出力でESR照射（TR = 1000 ms、TE = 40 ms、FA = 90度、TESR = 900 ms）で取得しました。 上と下の画像はそれぞれ元の DNP-MR 画像と差分 DNP-MR 画像を示します。 差分画像は、元の画像と「DNP OFF」画像を減算して得られます。 イメージング時間は、Asc 溶液と CoQ0 溶液を混合した後の開始時間を示しています。 混合物の注入 (10 秒間) は約 10 分で始まりました。 混ぜてから10秒後。 混合後のイメージングのスキャンの開始時間が示されます。

515〜530 MHzの範囲のESR照射周波数でCoQ0またはPQQを介したAFRの積極的に増強されたDNP-MR画像を取得することに成功しました。 CoQ0 媒介 AFR と PQQ 媒介 AFR はどちらも 30 ～ 105 秒のスキャン中に減衰しましたが、イメージング技術によってポジティブな増強を提供するのに十分な濃度を維持していました。 AFR、14N-CmP、および Oxo63 の間の 515 ～ 530 MHz の範囲の DNP スペクトルのスペクトル ピークの相対的な位置関係は、X バンド ESR スペクトルの相対位置関係とは異なりましたが、300 MHz のスペクトル ピークの相対位置関係と類似していました。 MHz ESRスペクトル。 これは、AFR の DNP 分光法が ESR 照射の周波数に依存することを示唆しています。 これらのサンプルの DNP スペクトルのスペクトル ピークを分離すると、14N-CmP および/または Oxo63 が存在する場合の AFR スペクトルを簡単に選択できます。

CoQ0 および PQQ 媒介 AFR のラジカル濃度に対する増強因子の比率は両方とも 14N-CmP、Oxo63 および FMNH サンプルの比率よりも高く、AFR の DNP に対するラジカル分子あたりの効率が高いことを示していることは注目に値します。 AFR、14N-CmP、FMNH間のESR照射の出力依存性の違いも、これらのDNPスペクトルが互いに重なり合っているにもかかわらず、AFRの選択的DNP-MRイメージングにとって利点を示しています。 たとえば、図2dでは、AFRのESR照射出力0.5および1Wでの画像強度は、それぞれ150μM 14N-CmP溶液およびFMNHサンプルの約2倍でした。 AFR の DNP 分光法から得られるこれらのタイプの特性情報は、少量の AFR の DNP-MR イメージングに大きな利点をもたらします。

周波数 515 ～ 530 MHz のマイクロ波は皮膚の深さまで cm レベルで浸透することが知られています13。 実際、マウスの胃および皮下で525 MHzのESR照射周波数で強化されたDNP-MR画像が得られました（図6）。 私たちのシステムでは、ESR照射とNMR信号検出の両方のプロセスが18.5 mTの外部磁場下で行われます。 ルーリーら。 らは、感度を高めるために ESR 照射には 5 mT、NMR 信号検出には 450 mT の高速スイッチング磁場を備えた磁場サイクル DNP-MR イメージング システムを報告し、明確な解剖学的構造を備えた強化された DNP 画像を取得しました 41。 NMRシグナル伝達の感度は磁場に依存して増加するため、このような戦略は将来の臨床応用に必要となる可能性があります。

高パワーでのESR照射では発熱が懸念されます。 AFRやOxo63などの線幅の狭いフリーラジカルでは、ニトロキシルラジカルに比べて比較的低い出力で高い増強が得られます（図2d）。 この研究では、1 回のスキャンで 3 W (TR = 1000 ms、TESR = 900 ms) の出力で ESR 照射を行っても、ファントムとマウスに顕著な温度上昇はありませんでした。

決定した AFR の DNP スペクトルを利用して、CoQ0 媒介 AFR の皮下および経口注射による in vivo DNP-MR イメージングを実証しました。 AFRの増強と化学的安定性のさらなる改善が必要である可能性があるが、外因的に投与されたAFR後の減衰様式は、組織の酸化還元状態のメーカーとして利用される可能性がある。

私たちの目的は、外因性AFRだけでなく内因性AFRの生体内DNP-MRイメージングを医療応用に向けてアプローチすることです。 現在までに報告されている内因性 AFR の濃度はナノモル範囲です (たとえば、虚血/再灌流傷害における AFR レベルは約 60 nM 42)。 したがって、DNP-MRI測定の感度を上げる必要があります。 液体サンプルの増強係数 (ε) は、式 ε = 1 − (|γe|/γn)〉fs/n で表されるように、結合 (ρ)、漏れ (f)、および飽和 (s) 係数に依存します。 γe は電子スピンの磁気回転比 (28.0 GHz/T)、γn は核スピンの磁気回転比 (陽子の場合は 42.6 MHz/T)、n は超微細分裂の数です。 エンキンら。 は、これらの要因が磁場、ESR 照射、およびサンプル温度の影響を受けると述べ、飽和係数がパルス電子-電子二重共鳴によって増加することを実証しました 43。 したがって、臨床MRイメージングシステムで広く使用されている1.5または3Tなどのより高い磁場下でのESR照射とNMR信号検出の改善により、DNP-MRI測定の全体的な感度が向上する可能性があります。

このような潜在的な AFR の DNP-MR イメージングには、AFR の DNP 特性に関する詳細な情報が必要です。 私たちの結果は、この実現に向けた第一歩です。 AFR の in vivo DNP-MR イメージング技術により、体内の酸化ストレスの特定の位置を正確に特定できるようになり、非侵襲的でリアルタイムのモニタリングが容易になる可能性があります。 その結果、酸化ストレスに起因する疾患や傷害の早期かつ確実な予防・評価が可能となる可能性があります。

近年、ビタミン C とメナジオンの併用投与 44 や高用量のビタミン C45 の静脈内投与に基づくがん治療など、ビタミン C を使用した新しい医療応用が開発されています。 これらの治療法では、AFR は反応プロセスで生成されます 33,46,47。これは、AFR の in vivo DNP-MR イメージングによって投与された薬剤の分布を追跡するために使用できる可能性があります。 CoQ0 は、イソプレン単位 (CoQ1 ～ CoQ10; CoQ) を持つさまざまな生物学的ユビキノン分子のコア構造です。 これらのユビキノンも Asc と反応して AFR を媒介すると考えられます。 ヒト CoQ10 によって媒介される AFR は、生体内イメージング プローブに使用できる可能性があります。 Asc 溶液と CoQ10 含有リポソーム懸濁液の反応で AFR 生成が発生することが観察されました (図 S-10)。ただし、AFR 生成は DNP-MR イメージングにはまだ十分ではありませんでした。 また、ＰＱＱ媒介ＡＦＲは、ＰＱＱが水溶性ヒトキノン分子であることを考慮すると、安全性の高い生体内イメージングプローブとして使用できる可能性がある。

私たちの実験では、酸化還元反応による AFR の生成のための CoQ10 とビタミン E の水溶性分子として CoQ0 と Trolox を使用しました。 CoQ とビタミン E は重要な酸化還元分子であり、それぞれミトコンドリアの電子輸送 (CoQ10) と生体膜での抗酸化に関与していることが知られています。 AFR の酸化還元代謝はこれらの分子の局在化と代謝によって影響を受けるため、これらの分子によって媒介される AFR の in vivo DNP-MR イメージングは​​、DNP スペクトル情報を使用してさまざまな酸化還元代謝を同時にモニタリングするのに役立つ可能性があります 23,29 。

AFR の DNP 特性に関するさらなる情報の生成は、AFR の DNP-MR イメージング技術を改善するさらなる可能性を提供するはずです。 L バンドや 300 MHz ESR などの低 ESR 周波数での分光 ESR 研究は、DNP-MR イメージング技術や ESR イメージングによる AFR の生体内検出を改善するための有用な情報を提供するでしょう。 DNP-MR イメージングにおける AFR の分光特性は、DNP 効果 49 を介して DNP-NMR 分光法 48 や ESR 分光法にも適用できます。 このような分光学的研究は、AFR の化学分析のための新しい方法に貢献するはずです。

我々は、Asc と水溶性キノン分子 (CoQ0 および PQQ) の間の酸化還元サイクル反応で生成される AFR について、515 ～ 530 MHz の低 ESR 照射周波数での in vitro DNP-MR イメージングを実証し、その類似点と相違点を明らかにしました。 AFR と一般的に使用されるフリーラジカル (14N-CmP および Oxo63) または in vivo DNP-MR イメージングの研究用の候補 (FMNH) との間の分光学的 DNP 特性。 DNP スペクトルにおける 14N-CmP および Oxo63 のスペクトルから AFR スペクトルを分離すると、AFR の選択的イメージングの利点が得られます。 AFR の DNP スペクトルの決定により、皮下および経口注射による CoQ0 媒介 AFR の in vivo DNP-MR イメージングが成功しました。

L(+)-アスコルビン酸ナトリウム、ユビキノン-0 [酸化型コエンザイム Q0 (CoQ0)] (2,3-ジメトキシ-5-メチル-1,4-ベンゾキノン)、FMN (リボフラビンリン酸ナトリウム)、NADH (β-ジホスホピリジンヌクレオチド二ナトリウム塩、還元型）、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩、Trolox（6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸）および18-クラウン-6（1,4,7,10、 13,16-ヘキサオキサシクロオクタデカン）は、和光純薬工業（大阪、日本）から購入しました。 14N 標識 3-カルバモイル-2,2,5,5-テトラメチル-1-ピロリジン-1-オキシル (カルバモイル-PROXYL) および Oxo63 (トリス[8-カルボキシ-2,2,6,6-テトラキス(2-ヒドロキシメチル)ベンゾ[1,2-d:4,5-d]ビス(1,3)ジチオ-4-イル]メチルラジカル、三ナトリウム塩)は、Sigma-Aldrich Chemical Co. (米国ウィスコンシン州ミルウォーキー) から購入しました。およびOxford Instruments（英国タブニーウッズ）。 KO2 は、Strem Chemicals Inc. (米国マサチューセッツ州ニューベリーポート) から入手しました。 水溶液の調製には超純水 (Milli Q) を使用しました。

C57/BL6 (メス、8 週齢) および ICR マウス (メス、5 週齢) は、Kyudo Co. (佐賀県、日本) から購入しました。 マウスは、12時間の明期と12時間の暗期のサイクルで気候制御された部屋に飼育され、環境に順応させるために水と餌（MF食、オリエンタル酵母株式会社、東京、日本）を自由に摂取させました。実験前に1週間環境を整えておきます。 すべての動物の管理および実験手順は、九州大学動物実験倫理委員会によって承認され、九州大学動物実験ガイドラインに従って実施されました。

X バンド ESR スペクトルは、Hyodo et al.29 による以前の報告に記載されているように、X バンド ESR 分光計 (モデル ES-FA100M、日本電子株式会社、昭島市) を使用して取得しました。 100 μL マイクロキャピラリー チューブ (Microcaps、Drummond Scientific Company、ブルーモール、ペンシルベニア州、米国) に移したサンプル (30 μL) を測定に使用しました。 各ラジカル溶液のラジカル濃度は、標準物質を用いてXバンドESR吸収スペクトルの総面積[付属のESRスペクトル解析ソフト(日本電子)を用いてシグナル積分と名付けた積分値として算出]から推定した。 14N-CmP のラジカル濃度と総面積の関係を示す曲線。 XバンドESR吸収スペクトルの信号強度をMn2+マーカーの信号強度との比で示します。 ダブレット AFR スペクトルの信号強度は、吸収スペクトルの左側のピークで示されています。

L バンド ESR スペクトルは、L バンド ESR 分光計 (JEOL モデル JES-LA2L および ES-27020) を使用して、室温、以下の条件で取得しました。マイクロ波周波数 1030 MHz。 中心磁場は37 mT。 マイクロ波出力10mW。 変調幅0.06mT。 掃引時間は 20 秒。 ±2.5mTの掃引幅。 時定数は0.03秒。 1 mL のサンプルをガラス管に移し、測定に使用しました。

300 MHz ESR スペクトルは、300 MHz ESR 分光計 (モデル JES-LA2L および ES-LLBA2/BU、日本電子) を使用して、室温、以下の条件下で取得しました。 中心磁場は10.4mT。 マイクロ波出力10mW。 変調幅0.06mT。 掃引時間は 20 秒。 ±2.5mTの掃引幅。 時定数は0.03秒。 測定には、ねじ蓋付きガラス瓶に入った 9 mL のサンプルを使用しました。

DNP-MRイメージングは​​、Hyodoらによる以前の報告に記載されている方法によって実行されました。 自家製のDNP-MRイメージングシステムを使用しており、ESR照射とMRイメージングの一連のプロセスは、約0.02Tの静的に固定された外部磁場の下で実行されます。ESR照射の周波数、出力、持続時間は変調によって変更可能です。周波数シンセサイザー (モデル N9310A、Agilent Technology、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) と ESR アンプ (モデル N146-509AA、タムウェイ株式会社、富士、日本) の例です。 14N-CmP水溶液に対して、ESR照射周波数471〜537MHzの範囲でDNPスペクトルを取得しました（図S-4）。

この研究では、自家製の 1 回巻き表面コイル (直径 20 mm)15 と特注の円筒形テフロン容器 (外径 18 mm、高さ 20 mm) (図 S-5a) を ESR 照射に使用しました。 ラジカル溶液の 300 μL サンプルをテフロン容器の 4 つのウェル (内径 5 mm、深さ 18 mm) のそれぞれに移しました。 したがって、水平面（冠状面）で最大 4 つのサンプルの DNP-MR 画像を同時に取得することができました。 一般的なスキャンに使用される条件は次のとおりです: 磁場 = 18.5 mT、MR イメージング周波数 = 0.793 MHz、ESR 照射周波数 = 515 ～ 530 MHz、ESR 照射出力 = ~ 3 W、90 度のフリップ アングル、ESR 照射時間(TESR)×繰り返し時間(TR)×エコー時間(TE) = 0.9 × 1 × 0.04 s、蓄積数 = 1、位相エンコードステップ数 = 64。 画像視野 (FOV: 32 × 32 mm) ) は 64 × 64 の行列で表されました。 各サンプルの DNP-MR 画像の強度は、Image J50 のソフトウェア パッケージを使用して、関心領域 (ROI) について分析されました。 ESR 照射パワーは、インライン ピーク パワー センサー (モデル MA24105A、アンリツ、厚木、日本) を使用して測定されました。

アスコルビン酸ナトリウムとキノン分子の水溶液を、室温、大気条件下で 1.5 mL マイクロチューブ内でピペッティングすることにより混合しました。 混合物を直ちに表面コイル内のテフロン容器に移し、DNP-MR イメージング システムの共振器にセットしました。 これらの作業は合計 30 秒で終了しました。 上記条件での DNP-MR イメージングのスキャンで 1 枚の画像を取得するのに要した時間は 75 秒でした。 したがって、スキャンは溶液の混合後 30 ～ 105 秒間実行されました。 このタイミングで全てのDNP-MR画像を取得するために、1枚の画像が取得されるたびにAscとキノン分子の混合物を新しいものと交換した。

同様の操作を ESR 測定でも実行しました (たとえば、X バンド ESR スペクトル測定用の混合物をマイクロキャピラリー チューブに移し、ESR 共振器内に 30 秒間静置させました)。 すべての ESR 分光分析の測定において、ダブレット AFR スペクトルの記録時間は、スペクトル全体の測定の開始時間を示すために使用されるのではなく、混合後のダブレット スペクトルの表示時間を示すために使用されました。

超酸化カリウム (KO2) を 0.4 M Trolox および 0.5 M 18-Crown-6 を含むエタノール溶液に 0.3 mg mL-1 の重量で添加し、Trolox ラジカルを生成しました。 １分間反応させた後、このトロロックスラジカル溶液と２．５Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液を等量混合し、ピペッティングによりトロロックスラジカルが消失するＡＦＲを作製した。 これらすべての手順は、1.5 mL マイクロチューブ内で大気条件下、室温で実行されました。 これらの Trolox および AFR ラジカル溶液のラジカル濃度は、メトキシカルボニル -PROXYL 含有エタノール/18-クラウン-6 溶液およびエタノール混合物のラジカル濃度と X バンド ESR スペクトルの総面積との関係を示す標準曲線を使用して推定されました。それぞれ/18-クラウン-6/トロロックスおよび14N-CmP水溶液。

C57BL/6Nマウスをイソフルランで麻酔し、ホルダープレート上に固定した。 裏面には表面コイルを貼りました。 AscとCoQ0の混合水溶液500μLを背中に皮下注射した後、直ちにマウスをDNP-MRシステムの共振器にセットし、DNP-MRイメージングを行った。 １日絶食させたＩＣＲマウスをウレタン麻酔し、ホルダープレートに固定した。 お腹には角型シングルコイルの自家製表面コイルを敷きました。 AscとCoQ0の混合水溶液500μLをゾンデを用いて胃内に経口注入した後、直ちにマウスをDNP-MRシステムの共振器にセットし、DNP-MRイメージングを行った。

この論文の引用方法：Ito, S. and Hyudo, F. アスコルビル フリー ラジカルの低 ESR 照射周波数での動的核分極磁気共鳴イメージング。 科学。 議員6、21407; 土井: 10.1038/srep21407 (2016)。

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医療レドックスナビゲーションイノベーションセンター（九州大学）の内海博博士、NIH/NCI放射線生物学部（米国）のCMクリシュナ博士、同校の安西K博士に感謝します。薬学部（日本薬科大学、日本）、創薬イノベーション研究センターの安川和也博士（第一薬科大学、日本）、長沼哲史博士（ジャパンレドックス株式会社、福岡、日本）には、多くの貴重なご意見をいただきました。議論。 DNP-MRイメージングの技術支援をしていただいた小林R氏に感謝いたします。 本研究は、文部科学省先端融合研究領域イノベーション拠点形成事業との共同支援によるものです。

Innovation Center for Medical Redox Navigation, Kyushu University, Maidashi, Higashi-ku, 812-8582, Fukuoka, Japan

Shinji Ito & Fuminori Hyodo

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SI は研究を考案、設計し、実験を実行し、原稿を書きました。 FH は研究を設計し、原稿を書きました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

この作品は、クリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材がクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Ito, S.、Hyodo, F. 低 ESR 照射周波数でのアスコルビル フリー ラジカルの動的核分極磁気共鳴イメージング。 Sci Rep 6、21407 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep21407

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受信日: 2015 年 11 月 2 日

受理日: 2016 年 1 月 22 日

公開日: 2016 年 2 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21407

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生物科学ジャーナル (2019)

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